一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，包括以下步骤：分离线虫和细菌：采用贝尔曼漏斗法分离供试木块中的线虫，采用稀释分离法分离线虫体表的细菌；制备细菌悬浮液；制备细菌无细胞培养液；施用细菌无细胞滤液：根据松树胸径大小施用细菌无细胞滤液，所述细菌无细胞滤液的使用频率为2年/次。本发明专利技术所述的一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，通过松树胸径的大小确定施药量，利用松材线虫体表细菌生态位的替换，有效降低松树患病率，提高松树存活率，延长其防治周期，打一次药剂可保2～3年，且本发明专利技术方法操作简单，成本低，利用本发明专利技术的方法治疗松树，松树成活率达到了99％。松树成活率达到了99％。

【技术实现步骤摘要】
一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法


[0001]本专利技术涉及松材线虫病防治
，特别涉及一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法。

技术介绍

[0002]松材线虫病是一种毁灭性的松树病害，俗称“松树的癌症”，是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的一种毁灭性松树病害，可危害50 多种松属树种和少数非松属树种。该病在美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、中国等均有发生，而日本最为严重。松材线虫病在20世纪80年代侵袭中国香港，几乎毁灭了香港分布广泛的马尾松林。1982年松材线虫病在中国南京中山陵首次被发现，随后相继在安徽、山东、浙江、广东等地形成几个疾病中心，并向四周扩散，在这些省的局部地区蔓延成灾，导致大批松树枯死，生态及经济损失巨大。
[0003]松墨天牛(Monochamus alternatus)是传播松材线虫病的主要媒介昆虫，松材线虫通过松墨天牛成虫取食和雌虫产卵造成的伤口侵入健康松树，使得松树在短期内大量染病死亡，因而控制松材线虫病的传播媒介(松墨天牛) 的扩散至关重要。
[0004]目前，国内外松材线虫病爆发，形势严重，损失巨大。松材线虫病的防治多采用物理、化学、生物等技术手段以控制松墨天牛的种群密度，如应用诱捕器、黑光灯、诱木诱杀等方法进行物理防治，但该物理防治大面积推广比较困难；采用人工与飞机喷药或树干注射药剂进行化学防治，一般采用具有触杀、胃毒、内吸作用和渗透性强的药剂，该化学防治成本较大、容易带来二次污染；而生物防治常以释放球孢白僵菌、金龟子绿僵菌等病原微生物粉剂和花绒寄甲及肿腿蜂等天敌昆虫为主，该生物防治方法成效较慢。因此，松材线虫病防治技术成为当前最为迫切需要解决的难题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的在于提供一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法和制备方法，可以有效解决
技术介绍
中的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤一、分离线虫和细菌：采用贝尔曼漏斗法分离供试木块中的线虫，采用稀释分离法分离线虫体表的细菌；
[0009]步骤二、制备细菌悬浮液：用划线法纯化细菌，挑细菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基里，置于恒温振荡培养箱震荡培养，用牛肉膏蛋白胨液体培养基稀释菌液，制备得到细菌悬浮液；
[0010]步骤三、制备细菌无细胞培养液：吸取1mL细菌悬浮液接种到40mL液体细菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，每40mL液体培养基中加入细菌2x10 7
CFU,置于恒温振荡培养箱振荡培养3～4天,取细菌培养液，再通过冷冻离心机离心10min,使细菌菌体沉淀,收集上清
液，并经滤膜孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤,所得滤液为细菌无细胞滤液；
[0011]步骤四、施用细菌无细胞滤液：根据松树胸径大小施用细菌无细胞滤液，所述细菌无细胞滤液的使用频率为2年/次。
[0012]优选的，在所述步骤一中，所述供试木块为美国进口的2个批次的木材包装箱。
[0013]优选的，在所述步骤二中，恒温振荡培养箱震荡培养的温度为26℃，震荡速度为120r/min。
[0014]优选的，在所述步骤三中，恒温振荡培养箱振荡培养的温度为28℃，震荡速度100r/min，离心机的速度为12000r/min。
[0015]优选的，在所述步骤S2中，土坑的尺寸为，长120～160cm，宽60～ 100cm，深20～30cm。
[0016]优选的，在所述步骤四中，施用细菌无细胞滤液的具体方法为：
[0017]S1、测量松树距离地面130～150cm处的胸径尺寸，根据胸径确定细菌无细胞滤液的剂量；。
[0018]S2、根据剂量在松树干上离地面30～80cm处斜向下35～45度角钻孔；
[0019]S3、注射完成后，用木塞堵住细菌无细胞滤液注射的孔。
[0020]优选的，在所述步骤S1中，细菌无细胞滤液的剂量的使用剂量为：当胸径为30cm以下时，细菌无细胞滤液的剂量用量为30mL；当胸径为31～35cm 时，细菌无细胞滤液的剂量用量为60mL；当胸径为36～40cm时，细菌无细胞滤液的剂量用量为90mL；当胸径为41～45cm时，细菌无细胞滤液的剂量用量为120mL；当胸径为46～50cm时，细菌无细胞滤液的剂量用量为180mL；当胸径为451～55cm时，免疫剂用量为210瓶；当胸径为56～60cm时，免疫剂用量为240mL。
[0021]优选的，在所述步骤S2中，每个孔注射30ml细菌无细胞滤液，所述钻孔为围绕着松树周身螺旋型均匀分布。
[0022]优选的，所述木塞需经杀菌处理。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0024]1、在本专利技术中，通过松树胸径的大小确定施药量，针对性强，有效降低松树患病率，提高松树存活率，延长其防治周期，打一次药剂可保2～3年，人工成本低。
[0025]2、在本专利技术中，利用从美国松材线虫体壁上分离和筛选的细菌菌株进行生物防治，该方法是把可快速替代我国松林内松材线虫体表的强致病细菌，使松材线虫失去致病能力，从而达到控制松材线虫病流行的目的。
[0026]3、本专利技术方法操作简单，成本低，效果明显，易于推广应用，利用本专利技术的方法治疗松树，松树成活率达到了99％。
附图说明
[0027]图1为本专利技术一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法的工艺流程图。
具体实施方式
[0028]为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合
具体实施方式，进一步阐述本专利技术。
[0029]在本专利技术的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利技术的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0030]在本专利技术的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本专利技术中的具体含义。
[0031]实施例一
[0032]如图1所示，一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，包括以下步骤：
[0033]步骤一、分离线虫和细菌：采用贝尔曼漏斗法分离供试木块中的线虫，采用稀释分离法分离线虫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、分离线虫和细菌：采用贝尔曼漏斗法分离供试木块中的线虫，采用稀释分离法分离线虫体表的细菌；步骤二、制备细菌悬浮液：用划线法纯化细菌，挑细菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基里，置于恒温振荡培养箱震荡培养，用牛肉膏蛋白胨液体培养基稀释菌液，制备得到细菌悬浮液；步骤三、制备细菌无细胞培养液：吸取1mL细菌悬浮液接种到40mL液体细菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，每40mL液体培养基中加入细菌2x107CFU,置于恒温振荡培养箱振荡培养3～4天,取细菌培养液，再通过冷冻离心机离心10min,使细菌菌体沉淀,收集上清液，并经滤膜孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤,所得滤液为细菌无细胞滤液；步骤四、施用细菌无细胞滤液：根据松树胸径大小施用细菌无细胞滤液，所述细菌无细胞滤液的使用频率为2年/次。2.根据权利要求1所述的一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，其特征在于：在所述步骤一中，所述供试木块为美国进口的2个批次的木材包装箱。3.根据权利要求1所述的一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，其特征在于：在所述步骤二中，恒温振荡培养箱震荡培养的温度为26℃，震荡速度为120r/min。4.根据权利要求1所述的一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，其特征在于：在所述步骤三中，恒温振荡培养箱振荡培养的温度为28℃，震荡速度10...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金云，汪东升，童立堂，赵克文，周斌，钱大林，项立升，张振，
申请(专利权)人：巢湖市友林林业有害生物防治有限公司，
类型：发明
国别省市：