基于金属有机框架材料监测扩增反应进程的方法及试剂盒，丙型肝炎病毒检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了基于金属有机框架材料监测扩增反应进程的方法及试剂盒，基于金属有机框架材料和滚环扩增的丙型肝炎病毒检测试剂盒，基于金属有机框架材料监测扩增反应进程的方法，包括以下步骤：取正在进行扩增的扩增反应液与金属有机框架材料悬浮液混合，得到混合液；直接将混合液进行荧光检测，根据荧光强度判断扩增反应进行的程度；金属有机框架材料能够与扩增反应过程中生成的副产物焦磷酸根发生反应，使得金属有机框架材料中的配体荧光恢复，该过程不需要等待，金属有机框架材料加入后可马上进行荧光检测，大大缩短了检测的时间并且操作简单，涉及的设备少，节约了检测成本，适用于床边检测和偏远地区的现场分析。适用于床边检测和偏远地区的现场分析。

【技术实现步骤摘要】
基于金属有机框架材料监测扩增反应进程的方法及试剂盒，丙型肝炎病毒检测试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及基于金属有机框架材料监测扩增反应进程的方法及试剂盒，基于金属有机框架材料和滚环扩增的丙型肝炎病毒检测试剂盒。

技术介绍

[0002]当前，恒温扩增技术在即时检测领域具有十分重要的地位。相比于PCR，恒温扩增无需复杂的仪器和程序性变温步骤，仅需加热甚至水浴即可满足扩增反应的需求。
[0003]目前常见的恒温扩增技术有：环介导等温扩增(LAMP)、重组聚合酶扩增(RPA)、链置换扩增(SDA)、依赖解旋酶的扩增(HDA)、切口酶介导的扩增反应(NEAR)等，以上技术的出现为即时检测提供了有力工具，然而一个重要问题仍然限制恒温扩增现场即时检测，即对扩增产物的快捷的和特异的检测。
[0004]目前有大量方法运用于核酸扩增结果的检测，如电泳、荧光染料、浊度等，上述技术虽然具有各类优势，但是对检测环境具有一定的要求，从而限制了应用；如电泳法，通过不同DNA在凝胶中的迁移速率不同实现各DNA的分离与表征，除了其本身试剂和染色剂有毒外，还存在比较耗时(至少2小时)、费力(制胶、加样、电泳、染色、成像，步骤较多)、灵敏度较低、一般只能实现半定量等问题。
[0005]对于恒温扩增技术而言，随着核酸扩增过程的进行，实时释放大量的焦磷酸，可通过实时检测焦磷酸含量从而达到检测核酸扩增产物的目的；而焦磷酸酶沉淀法通过反应中产生的焦磷酸与镁离子作用产生沉淀来判断反应的进程，会存在离子干扰较为明显、灵敏度低、定量困难等问题。对于钙黄绿素荧光目视法检测焦磷酸，由于钙黄绿素对钙、锶、钡等多种离子的络合能力，会存在比较严重的离子干扰。同时，对于扩增产率比较低的样品时，其本身焦磷酸产量不足，因而钙黄绿素的荧光恢复不明显。

技术实现思路

[0006]针对现有的电泳、焦磷酸镁沉淀等核酸扩增产物检测方法存在的上述问题，本专利技术提供一种基于金属有机框架材料监测扩增反应进程的方法及试剂盒，并针对目前的床边检测及偏远地区快速检测需求，提供一种基于金属有机框架材料和滚环扩增的丙型肝炎病毒检测试剂盒。
[0007]在第一方面，本专利技术采用以下技术方案：一种基于金属有机框架材料监测扩增反应进程的方法，包括以下步骤：取正在进行扩增的扩增反应液与金属有机框架材料悬浮液混合，得到混合液；直接将混合液进行荧光检测，根据荧光强度判断扩增反应进行的程度。
[0008]进一步限定，所述金属有机框架材料以锆为金属中心、以2
‑
氨基对苯二甲酸为配体。
[0009]进一步限定，所述金属有机框架材料由以下步骤制备得到：
[0010]将890
‑
950质量份四氯化锆，690
‑
745质量份2
‑
氨基对苯二甲酸和9604
‑
9941质量
份苯甲酸在N,N
‑
二甲基甲酰胺中超声混合，再转移到介质阻挡放电合成管中，连通电路，在25
‑
34V，0.8
‑
1.7A条件下合成28
‑
34min。
[0011]进一步限定，所述金属有机框架材料悬浮液中金属有机框架材料的浓度为10mg/mL
‑
500mg/mL。
[0012]进一步限定，所述金属有机框架材料悬浮的体积与扩增反应液的体积比为2
‑
4：1。
[0013]进一步限定，所述扩增反应为能够消耗dNTP产生焦磷酸根的扩增反应。
[0014]进一步限定，所述扩增反应为聚合酶链式反应、重组酶聚合酶扩增、环介导等温扩增或滚环扩增中的一种。
[0015]本专利技术的工作原理为：2
‑
氨基对苯二甲酸自身具有荧光性质，在合成金属有机框架材料后，由于金属中心锆(Zr)与配体2
‑
氨基对苯二甲酸之间的电荷转移作用，使得2
‑
氨基对苯二甲酸荧光消失，焦磷酸根可与Zr反应，影响其与2
‑
氨基对苯二甲酸之间的电荷转移作用，使得2
‑
氨基对苯二甲酸荧光恢复，因此金属有机框架材料(UiO
‑
66
‑
NH2)可对焦磷酸根产生特异性响应；
[0016]许多扩增反应过程中，会消耗dNTP使得DNA进行扩增，并产生副产物焦磷酸根，因此焦磷酸根可以反映扩增反应的进程，扩增反应进行越多，焦磷酸根浓度越高；故而金属有机框架材料UiO
‑
66
‑
NH2可用于扩增反应的进程监测。
[0017]本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的金属有机框架材料能够与扩增反应过程中生成的副产物焦磷酸根发生反应，使得金属有机框架材料中的配体荧光恢复，该过程不需要等待，金属有机框架材料加入后可马上进行荧光检测，大大缩短了检测的时间(约几分钟)，并且操作简单(一步混合)，涉及的设备少(仅需荧光检测仪或紫外灯)，节约了检测成本；在待检测液的浓度较低也能够产生较强的荧光信号，可通过荧光检测仪检测进行定量分析，或紫外灯下直接观测进行半定量分析，并且其他离子不与该金属有机框架材料反应，减少了干扰。
[0018]本专利技术公开的金属有机框架材料UiO
‑
66
‑
NH2制备方法(DBD合成)，操作简单(一步混合后通电)，耗时短(30分钟，传统水热法需24小时)，制备得到的金属有机框架材料性质稳定，在室温下具有长时间的保质期(至少三年)。
[0019]在第二方面，本专利技术还公开了一种基于金属有机框架材料监测扩增反应进程的试剂盒，试剂盒仅包括盒体和金属有机框架材料干粉；所述金属有机框架材料为以锆为金属中心、以2
‑
氨基对苯二甲酸为配体。
[0020]本专利技术的有益效果：基于金属有机框架材料的扩增反应进程监测试剂盒，操作简单、结果读取快速、方便，利于偏远地区检测和现场分析。
[0021]在第三方面，本专利技术还公开了一种基于金属有机框架材料和滚环扩增的丙型肝炎病毒(HCV)检测试剂盒，包括金属有机框架材料干粉、DNA模板、DNA连接酶以及DNA聚合酶；所述金属有机框架材料以锆为金属中心、以2
‑
氨基对苯二甲酸为配体；
[0022]进一步限定，所述DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，5
’
端修饰磷酸基团，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶，所述DNA聚合酶为Phi29 DNA聚合酶。
[0023]本专利技术的工作原理为：在滚环扩增反应中，需要一条寡核苷酸与DNA模板结合并在DNA连接酶作用下形成环状模板，再经DNA聚合酶作用完成滚环扩增，其中寡核苷酸、DNA模板、DNA连接酶、DNA聚合酶以及其余反应条件都会影响滚环扩增反应进程，因此寡核苷酸可
与滚环扩增的反应进程产生直接联系；故而设计寡核苷酸为HCV
‑
cDNA，HC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于金属有机框架材料监测扩增反应进程的方法，其特征在于，包括以下步骤：取正在进行扩增的扩增反应液与金属有机框架材料悬浮液混合，得到混合液；直接将混合液进行荧光检测，根据荧光强度判断扩增反应进行的程度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属有机框架材料以锆为金属中心、以2
‑
氨基对苯二甲酸为配体。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属有机框架材料由以下步骤制备得到：将890
‑
950质量份四氯化锆，690
‑
745质量份2
‑
氨基对苯二甲酸和9604
‑
9941质量份苯甲酸在N,N
‑
二甲基甲酰胺中超声混合，再转移到介质阻挡放电合成管中，连通电路，在25
‑
34V，0.8
‑
1.7A条件下合成28
‑
34min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属有机框架材料悬浮液中金属有机框架材料的浓度为10mg/mL
‑
500mg/mL。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：程南生，陈骏伯，胡昌佳，周荣幸，张捷，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：