以具内标的LC-MS在样品中进行聚山梨醇酯定量的方法技术

本申请是关于通过实施具内标的LC

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】以具内标的LC
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MS在样品中进行聚山梨醇酯定量的方法


[0001]本专利技术涉及在生物治疗剂样品中定量聚山梨醇酯的分析方法。聚山梨醇酯(例如PS80)是生物治疗剂调配物中的最常用表面活性剂。

技术介绍

[0002]聚山梨醇酯常用于生物医药调配物中的两亲性非离子表面活性剂。其主要作用是保护蛋白质及单克隆抗体(mAb)免于界面诱导的聚集。聚山梨醇酯(例如PS80)是多于1500种分子的异质混合物，其涵盖宽范围的物理
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化学性质且包括各种脂肪酸。PS80定义为聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯，但由于其合成方法，其是异质混合物，其也已知易于发生自氧化及经酯化脂肪酸的酶水解。PS80异质性的主要来源可归因于酯键及其中所涉及的几种脂肪酸。实际上，有几篇著作报导存在大量(高达34.1％)的二酯且有时甚至高级酯(Borisov等，Pharm.Biotechnol.2015,104,1005
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1018)。此复杂性对于PS80定量及降解监测而言代表巨大挑战。
[0003]在最近评论中(Martos等J.Pharm.Sci.2017,106,1722
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1735)，阐述用于PS80监测的不同方法。所报导方法是基于不同检测技术，这些技术主要与液相层析(LC)串联。在所提及的方法中，能够定量PS80的那些方法对各种PS80降解均不敏感。举例而言，具有ELSD或CAD的基于混合模式液相层析的方法适于PS80定量，但在PS80降解的情形中并非最敏感的方法。基于质谱(MS)的方法通常用于PS80表征，但并不用于在质量控制(QC)环境中的PS80定量及监测。关于PS80的液相层析质谱(LC
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MS)表征的最新进展是基于二氧戊环基鎓(dioxolanylium)离子的特征信号(Borisov等Anal.Chem.2011,83,3934
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3942)。所报导的这些特征信号的使用提及其对解释及鉴别PS80物种且尤其脂肪酸组成的有用性。其还已用于PS80氧化副产物的结构解析(Borisov等，2015,上文文献)。迄今为止，这些信号尚未用于PS80定量。自所获得的层析图仅能撷取到相对或半定量信息(Borisov等，2011,上文文献)。
[0004]因此，仍期望提供有效且稳健的方法以允许在单一分析中进行聚山梨醇酯定量。

技术实现思路

[0005]根据目标，本专利技术提供用于在样品中定量至少一种聚山梨醇酯衍生物的方法，该方法包含：
[0006]‑
基于二氧戊环基鎓离子的信号实施所述样品的LC
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MS分析的步骤；
[0007]‑
利用所述聚山梨醇酯的内标实施内部校正的步骤。
[0008]尽管使用内标(IS)是层析及质谱的众所周知的做法，但从未报导使用IS进行聚山梨醇酯定量。通过使用内标(IS)，改良线性度、可重复性、准确度且因此改良定量。
[0009]该方法的一个关键特征是使用内标用于内部校正目的以避免基质效应的问题。通常，此内标作为完整聚山梨酸酯的替代物具有相似的化学结构且经历相同的源内断裂。根据本专利技术，该方法依赖于通过源内解离生成的脂肪酸酯的特征二氧戊环基鎓离子。
[0010]通过使用精心选择的内标，该方法允许定量典型mAb调配物中的聚山梨醇酯。
[0011]根据本申请的实施方案，聚山梨醇酯是式(I)化合物的混合物：
[0012][0013]其中w、x、y及z相同或不同，独立地代表式(I)中的聚乙二醇单元数且不为0。
[0014]根据本申请的实施方案，w+x+y+z＝20，其中聚山梨醇酯特别地是PS20或PS80。
[0015]根据本申请的实施方案，所述聚山梨醇酯是PS20或PS80。PS20及PS80是可市售购得的(具体而言来自Seppic
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Puteaux,France)。
[0016]根据本申请的实施方案，所述LC
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MS分析涉及单个四极质量检测器，例如(自Waters购得)。通过在QDa质量检测器中使用源内断裂，自聚山梨醇酯生成二氧戊环基鎓离子。QDa能够在同一分析运行中在正及负两种电离模式下并行实施多个单离子记录(SIR)信号。这允许定量完整的聚山梨醇酯，寻找特征聚山梨醇酯氧化副产物以及定量游离油酸(聚山梨醇酯水解的副产物)。通常，在PS80的情形中，追踪最少四个SIR信号：一个用于油酸酯的二氧戊环基鎓离子(完整PS80的特定离子)，一个用于IS的二氧戊环基鎓离子，一个用于在负电离模式下的游离油酸(PS80水解的主要副产物)，一个用于氧化的油酸酯(氧化的PS80的主要副产物)的二氧戊环基鎓离子。可记录其他信号用于信息目的。
[0017]根据本申请的实施方案，该方法允许追踪与PS80降解的副产物有关的SIR信号：在水解的情形中油酸(SIR负m/z 281.3)及在氧化的情形中氧化的油酸酯(SIR正m/z 325.3)。
[0018]这种新的方法允许在仅一次分析中获得至少相同水平的信息，由此减少分析PS80所花费的时间。通过此方法收集的信息更易于理解，这是由于分析物对完整的PS80或降解的PS80的标记物实际上均是特异性的。
[0019]因此，根据实施方案，该方法还包括检测所述聚山梨醇酯的氧化及/或水解的步骤。与现有方法相反，本专利技术方法允许在无论是发生可使PS80化合物的总浓度减小的降解(氧化或水解)还是吸附的调配物中定量PS80。
[0020]图2(b)说明用于定量完整PS80的m/z 309.3处的SIR信号。根据实施方案，该方法可通过使用对PS80氧化及PS80水解二者敏感的适宜替代物定量完整PS80。单酯对降解更敏感且可用作聚山梨醇酯定量的替代物。根据实施方案，完整聚山梨醇酯的该特定替代物可为单酯。对于PS80，替代物是在图2(b)中鉴别为峰2.1的化合物。通常，视实验条件而定，此峰具有包含在6与7分钟之间的滞留时间；更特定地，在下文实验部分所述的实验条件下，峰具有包含在6.85min与6.95min之间、更具体地约6.9min的滞留时间。使用此替代物，在因水解或氧化而降解的情况中，此方法的使用与完整PS80定量相关。先前发布的方法均未能如此。
[0021]如本文所用，“内标”是指在化学分析中以恒定量添加至样品、空白及校正标准品的化学化合物。然后可通过绘制聚山梨醇酯信号与内标信号的比率随标准品中聚山梨醇酯浓度的变化将此化合物用于校正。内标是通常与样品中的聚山梨醇酯极为相似但不相同的
化合物，这是由于在理想情况下，相对于每一物种的量，样品制备的效应对于来自内标的信号与来自感兴趣物种的信号应是相同的。所用内标通常需要提供与聚山梨醇酯信号在大多数方面相似但又足够不同的信号，以使该两个信号可通过仪器容易地区分。
[0022]内标在结构上通常应与感兴趣分析物相似，与感兴趣分析物相比具有相似滞留时间，且应经历相似源内断裂。其亦必须稳定且不能干扰样品组分。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种于样品中定量至少一种聚山梨醇酯衍生物的方法，所述方法包含：
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基于二氧戊环基鎓离子的信号实施所述样品的LC
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MS分析的步骤；
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利用所述聚山梨醇酯的内标实施内部校正的步骤。2.根据权利要求1的方法，其中所述聚山梨醇酯是PS20或PS80。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述内标是式(I)的乙氧基化脂肪酸：其中：代表脂肪酸残基；其中R代表C3
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C24直链或具支链饱和烷基；R
’
是H或其中R”代表C3
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C24直链或具支链饱和烷基；且n是包含在1与100之间；及其混合物。4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述内标是选自：聚(乙二醇)双(2
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乙基己酸酯)其中n是包含在1与100之间。5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述内标是n...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：