微滴操作方法技术

提供了操作微滴的方法，所述微滴的平均体积在0.5飞升至10纳升范围内，所述微滴包含至少一种生物成分和第一水性介质，所述第一水性介质具有小于1的水活度a

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】微滴操作方法
[0001]本专利技术涉及操作含水微滴的改进方法，所述微滴任选地包含在不混溶的载体流体例如油中的生物细胞。它能够控制或调整微滴的大小，并且在给定的时间内保持或优化微滴内发生的任何酶促或化学反应。
[0002]在我们之前的专利申请，例如WO2014167323、WO2015121675、WO2016012789、WO2017140839和PCT/EP2018066574中，我们已经描述了其中生物成分例如细胞、酶、寡核苷酸甚至单核苷酸在微滴内进行操作的方法，用于进行一系列分析，包括DNA和RNA测序以及细胞和病毒的检测和表征。在一些实施方案中，这些方法涉及使用电润湿推进力沿分析装置中的微流体路径转移分散在不混溶的载体流体中的微滴或通过将微滴直接印刷到涂覆有载体流体的基片上。在许多情况下，其中微滴的体积分数相对较低，我们发现这些微滴易于随着时间的推移发生显著收缩，这有时会干扰微滴内部进行的部分或全部酶促过程。此外，在其他情况下，在执行给定分析时，可能需要有意地使装置的一部分中的微滴的尺寸收缩或生长。
[0003]我们现在开发了克服这些问题的微滴操作方法。例如，它可用于操作微滴内容物的大小和/或反应性，或控制其中发生的化学或酶促反应。本专利技术如所附权利要求中所定义。根据本专利技术的第一方面，提供了一种操作(控制其内容物的大小和/或化学组成)微滴的通用方法，所述微滴的平均体积在0.5飞升至10纳升的范围内，所述微滴包含至少一种生物成分和第一水性介质组成，所述第一水性介质具有小于1的水活度a
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，其特征在于将微滴保持在与水不混溶的载体流体中的步骤，所述载体流体还包括平均体积小于所述微滴的25％的平均体积达到并包括最大4飞升的第二水性介质的次级液滴，并且其中每单位体积总量中载体流体与微滴总体积的体积比大于2:1。
[0004]不希望限制本专利技术的范围，据信本专利技术通过使用包含非常小的次级液滴的载体流体解决了该问题，次级液滴可以与微滴相互作用而不会对微滴的整体特性或应用于它们的任何检测方法的效力产生不利影响。当载体介质是油时，这种复合介质有时被称为“水合油”。在这方面的重要特征是微滴和次级液滴的相对水活度控制在某些参数内；任选地通过连续监测和/或反馈回路。此处，水性介质的水活度(a
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)定义为在STP条件下所研究的水性介质与纯水的蒸汽分压之比。由于水倾向于沿着从高水活度到低水活度的梯度扩散，我们发现，在我们系统的限制范围内，当第二水性介质(a
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)的水活度高于第一水性介质(a
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)的水活度时，净效应是微滴经历膨胀，直到两个组分的水活度相等。相反地，当第二水性介质的水活度高于第一水性介质的水活度时，微滴将趋于收缩，直到这些水活度相等。在一个有用的实施方案中，第一和第二水性介质的水活度可以相同或基本相同，从而连续抵消微滴收缩或膨胀的任何趋势。因此，可以始终保持微滴的尺寸。我们还发现，通过这些方式，这些次级液滴可用于帮助保持甚至增强微滴中发生的任何酶促或化学反应；例如，通过使用次级液滴将细胞生长成分提供给采用该方法的任何设备中的一个或多个点上的微滴。在一个实施方案中，第一和第二水性介质可以具有相同的组成。
[0005]因此，在本专利技术的一个实施方案中，第一和第二水性介质的水活度独立地在0.9至1的范围内。在另一个实施方案中，第一水性介质的水活度为0.9至小于1。在又一个实施方
案中，第一和第二水性介质的水活度之比(a
w1
:a
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)在0.9:1至1:0.9的范围内。
[0006]执行操作的一种方便的方法是使用为缓冲液的第一和第二介质；并且，如果需要，通过改变两者的相对组成。例如，在一个应用中，第一水性介质的离子强度为第二水性介质的离子强度的1至5倍；优选3至5倍。另一方面，第二水性介质的离子强度为第一水性介质的离子强度的1至5倍；优选3至5倍。在又一应用中，离子强度相同或基本相同，离子强度的比值在3:1至1:3的范围内。在一个特别有用的实施方案中，第一和第二水性介质中的任一个或两者可以包括甘油作为组分；例如，以不同的浓度。另一方面，第一和第二水性介质的pH值相同或相似并且在6.5至8的范围内。
[0007]至于次级液滴，它们的平均体积比微滴的平均值小得多，并且在极限情况下可能包含第二水性介质的毫微微大小的液滴或胶束，所述第二水性介质在载体流体中乳化并通过相容的表面活性剂分子；例如，非离子表面活性剂的覆盖稳定。在一个实施方案中，这些次级液滴的尺寸小于所用微滴体积的10％，优选小于5％。另一方面，次级液滴的平均体积在微滴平均体积的10％至1％的范围内。合适地，次级液滴在载体流体中形成稳定乳液的一部分，在一个实施方案中，所述载体流体是不混溶的油。合适地，载体流体选自矿物油、硅油或氟碳油。如果需要，油还可以包含额外的表面活性剂和稳定剂。适当地，载体流体与微滴总体积的体积比大于3:1；优选5:1或更大。
[0008]本专利技术的方法可用于分析生物细胞的多种应用。一个例子是使永生化哺乳动物细胞培养物在微滴内增殖，目的是筛选细胞的单个克隆拷贝以获得所需的特征，例如蛋白质表达或特定的遗传性状。因此，在本专利技术的第二方面，在一个实施方案中，提供了使包含在微滴内的一种或多种细胞类型细胞增殖的方法，所述微滴的平均体积在4飞升至10纳升范围内且包含水性缓冲液，所述方法包括在合适的环境条件下温育液滴内的细胞并随后检测每个液滴内的细胞数量的步骤，其特征在于微滴悬浮在不混溶的载体流体中，所述载体流体还包括次级液滴，所述次级液滴的平均体积小于微滴平均体积的25％，达到并包括最大4飞升，并且其中每单位体积总量中载体流体与微滴总体积的体积比大于2:1。
[0009]在另一个实施方案中，还提供了检测所考虑细胞的一个或多个表型特征、遗传性状或蛋白质表达谱的方法，所述细胞包含在微滴内，所述微滴的平均体积在4飞升至10纳升范围内，并且包含含水生长培养基，所述方法包括以下步骤：用荧光探针标记源自细胞的靶标并随后检测来自探针的输出，其特征在于含有细胞的微滴悬浮在不混溶的载体流体中，所述载体流体还包括次级液滴，所述次级液滴的平均体积小于微滴平均体积的25％，达到并包括最大4飞升，其中每单位体积总量中载体流体与微滴总体积的体积比大于2:1。适用于该目的的荧光探针分子是众所周知的，并且包括荧光标记的抗体、FRET报告探针和酶标记的抗原，它们在靶蛋白存在时被降解。
[0010]在另一个实施方案中，提供了分析源自包含在微滴中的生物细胞的寡核苷酸的方法，所述微滴的平均体积在4飞升至10纳升范围内且进一步包含水性缓冲液，所述方法包括以下步骤：用荧光杂交探针标记寡核苷酸，并随后检测相应的荧光，其特征在于微滴悬浮在不混溶的载体流体中，所述载体流体还包含平均体积小于微滴平均体积的25％、达到并包括最大4飞升的次级微滴，其中每单位体积总量中载体流体与微滴总体积的体积比大于2:1。
[0011]可用于此目的的荧光杂交探针是本领域众所周知的，并且包括分子信标、
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.操作微滴的方法，所述微滴的平均体积在0.5飞升至10纳升的范围内，所述微滴包含至少一种生物成分和第一水性介质，所述第一水性介质具有小于1的水活度a
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，所述方法的特征在于将微滴保持在与水不混溶的载体流体中的步骤，所述载体流体还包括次级液滴，所述次级液滴包含平均体积小于所述微滴的25％、高达并包括最大4飞升的第二水性介质，并且其中每单位体积总量中载体流体与微滴总体积的体积比大于2:1。2.根据权利要求1的方法，其用于操作微滴的内容物的大小和/或化学或酶促反应性，所述微滴的平均体积在0.5飞升至10纳升范围内；所述微滴包含至少一种生物成分和不含生物细胞的第一水性介质，所述第一水性介质的水活度a
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小于1，所述方法的特征在于将微滴保持在与水不混溶的载体流体中的步骤，所述载体流体进一步包括次级液滴，所述次级液滴包含第二水性介质，且所述次级液滴的平均体积小于微滴平均体积的25％、高达并包括最大0.5飞升，并且其中每单位体积总量中载体流体与微滴总体积的体积比大于2:1。3.根据权利要求1的方法，其用于控制微滴中的化学或酶促反应性和/或微滴大小，所述微滴的平均体积在4飞升至10纳升范围内；所述微滴包含至少一种生物细胞和第一水性介质，所述第一水性介质的水活度a
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小于1，所述方法的特征在于将微滴保持在与水不混溶的载体流体中的步骤，所述载体流体进一步包括次级液滴，所述次级液滴包含第二水性介质，且所述次级液滴的平均体积小于微滴平均体积的25％、高达并包括最大4飞升，并且其中每单位体积总量中载体流体与微滴总体积的体积比大于2:1。4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于次级液滴具有大于a
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的水活度a
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。5.根据权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于次级液滴具有小于a
w1
的水活度a
w2
。6.根据权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于水活度a
w1
和a
w2
相同。7.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于a
w1
和a
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独立地在0.9至1的范围内。8.根据权利要求4的方法，其特征在于第二水性介质的离子强...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤姆，
申请(专利权)人：光投发现有限公司，
类型：发明
国别省市：