一种体外快速检测胱抑素C的试纸条的制备方法技术

本发明专利技术属于检测试纸条技术领域，具体涉及一种体外快速检测胱抑素C的试纸条的制备方法，所述方法为首先制备免疫金，然后使免疫金与胱抑素C单克隆抗体形成免疫金复合物，再制备免疫层析试纸条。本发明专利技术方法制备的试纸条的检测样本是尿液，可以快速诊断胱抑素C，在诊断慢性肾病上，具有突破性的、重要的临床诊断意义。义。

【技术实现步骤摘要】
一种体外快速检测胱抑素C的试纸条的制备方法


[0001]本专利技术属于检测试纸条
，具体涉及一种体外快速检测胱抑素C的试纸条的制备方法。

技术介绍

[0002]肾损害是糖尿病、高血压患者的并发症之一。肾损害会生成慢性肾病。
[0003]慢性肾病(Chronic Kidney Disease，CKD)是威胁人类健康的重大疾病之一，中国是CKD的高发地区，目前约有2.5亿成人患者，成人发病率已超过20％，并呈逐年上升趋势。由于早期症状不明显，不易引起重视，CKD存在知晓率低、发现晚等现象。
[0004]随着CKD的发展逐渐加重并伴随其它并发症的出现，医疗支出也随之大大增加，往往给患者家庭带来沉重的经济负担。如能实现尽早诊断，及早治疗，将有效减少或延缓终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)的发生，同时显著减少慢性肾病和心血管疾病所导致的死亡数和残疾数，减轻医疗负担。
[0005]肾脏疾病被喻为“沉默的杀手”，早期基本没有症状，只有通过早期检测来发现和控制疾病的发展。对糖尿病、高血压或是有肾衰竭家族史的高危人群而言，由于所患疾病会对肾脏带来损伤，增加CKD患病风险，因此更应定期接受慢性肾病检查。
[0006]肾脏疾病检测的标志物，目前主要通过两种方法。
[0007]一种是用尿中查出的尿白蛋白作为肾脏损伤的标志物，尿白蛋白是在血液中发现的一种蛋白，健康的肾脏不会把白蛋白传递至尿液中。受损的肾脏会把部分白蛋白传递至尿液。尿液中的白蛋白含量越少越好。当尿白蛋白结果<30>30mg/24h表示可能有肾病。
[0008]另一种是用“血肌酐”标志物测定肾小球滤过率(GlomerularFiltration Rate，GFR)，用于衡量肾脏是否能正常过滤血液。
[0009]GFR≥60为人体正常范围，GFR<60时提示可能有肾病，GFR≤15时提示可能有肾衰。
[0010]但是，以上二种检测方法都存在局限性。在CKD的1期和2期，GFR开始缓慢下降，但还无法检测出蛋白尿。只有在肾脏已经出现严重受损的3期至5期，才能检测出蛋白尿。因此，仅采用蛋白尿标志物很难检测出1期和2期肾脏疾病。
[0011]目前临床最常用的GFR检测指标为血肌酐，但敏感度不高。只有当大约50％的肾功能丧失后，血清肌酐才会有显著上升。在GFR缓慢下降的CKD前期，通过肌酐很难检测出肾功能衰退，因此被标记为“肌酐盲区”。
[0012]此外，肌酐水平极大程度上受到人体肌肉质量影响，与肌肉代谢直接相关，且在不同年龄性别人群中的表达也存在差异。男性体内的肌酐含量高于女性，儿童时期的肌酐水平随年龄增加，而老年人随着肌肉含量的下降，根据肌酐的水平会出现高估肾功能的状况。
[0013]肌酐水平也可能受到胆红素、透析、血糖和药物等因素影响。因此，仅通过肌酐检测计算出的GFR灵敏度、准确性有限，尤其在CKD早期不能有效反映GFR的下降情况。
[0014]另外，目前医院检测血肌酐的样本是血清，需要抽取检查者的血液，方法上费时且是创伤性的。
[0015]1983年，研究人员首次在鸡蛋清中分离纯化出半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cysteine Proteinase Inhibitor，CPI)，后命名为胱抑素C(Cystatin C，Cys C)。作为一种低分子量的碱性非糖化蛋白质，胱抑素C是在人体内以恒定速度产生，并存在于各种体液之中，能自由从肾小球滤过，在近曲小管能全部被吸收，且吸收后被完全降解，不再进入血循环。无组织特异性(包括肾、肝、胰、肠、胃、肺及胎盘等)。
[0016]胱抑素C(Cys C)代谢特点：
[0017]产生速率恒定，不受其他因素如饮食、炎症和血脂水平等的影响，且与人种、性别、年龄、肌肉量无关；自由通过肾小球滤过，无肾小管分泌；在近曲小管能全部被吸收；吸收后被完全降解，不再进入血循环。
[0018]值得注意的是，胱抑素C能检测出肌酐无法检测到的1期和2期肾病，帮助轻度肾功能不全的患者实现早期诊断，以便及时进行治疗。同时，胱抑素C还有助于CKD的早期检测，帮助推迟CKD的恶化。相比血肌酐，胱抑素C是更为灵敏和具特异性的慢性肾病早期检测标志物。
[0019]现有注册上市的“胱抑素C”体外诊断试剂盒有以下不足：
[0020]检测胱抑素C的体外诊断试剂盒是采用免疫比浊法，产品运输和保存过程需2～8℃下冷藏；检测样本是人的血清和血浆，是一个创伤性、方法费时的操作过程。
[0021]因此，提供一种检测样本是尿液、快速诊断胱抑素C的产品，在诊断慢性肾病方法上，具有突破性的、重要的临床诊断意义。

技术实现思路

[0022]本专利技术主要提供了一种体外快速检测胱抑素C的试纸条的制备方法，该试纸条检测样本是尿液，可以快速诊断胱抑素C，在诊断慢性肾病上，具有突破性的、重要的临床诊断意义。其技术方案如下：
[0023]一种体外快速检测胱抑素C的试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0024]Ⅰ制备免疫金复合物：
[0025](1)将胱抑素C单克隆抗体加入到胶体金溶液中，室温进行反应；
[0026](2)加入牛血清白蛋白以饱和游离的胶体金；
[0027](3)离心处理，离心所得沉淀用含牛血清白蛋白的缓冲液进行多次清洗，得到免疫金复合物；
[0028]Ⅱ制备免疫层析试纸条：
[0029](1)将免疫金复合物喷洒在玻璃纤维素膜上制成金标垫；
[0030](2)在硝酸纤维素膜的检测线上包被胱抑素C单克隆抗体，质控线上包被羊抗鼠IgG单克隆抗体；
[0031](3)将样品垫、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次组装在PVC底板上，按需裁切成合适宽度的试纸；
[0032](4)将裁切好的试纸条装在卡壳里，压紧卡壳后即可用于检测。
[0033]优选的，所述胶体金溶液的制备方法如下：
[0034](1)将氯金酸水溶液加热至沸；
[0035](2)边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液；
[0036](3)继续加热煮沸，淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后变灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成红色后停止加热，冷却即可。
[0037]优选的，所述胱抑素C单克隆抗体由杂交瘤细胞系5F2或杂交瘤细胞系1E11分泌制得，杂交瘤细胞系5F2保藏号为：CCTCC NO:C201239，杂交瘤细胞系1E11保藏号为：CCTCC NO:C201253。
[0038]优选的，所述胱抑素C单克隆抗体的制备方法为：使用佐剂预处理小鼠，在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞系5F2或杂交瘤细胞系1E11，分泌单克隆抗体，然后抽取腹水，分离获得所述胱抑素C单克隆抗体。
[0039]优选的，分离获得所述胱抑素C单克隆抗体的具体方法为：收集腹水，并用硫酸铵、辛酸沉淀，然后用ProteinG预装层析柱纯化沉淀，获得胱抑素C单克隆抗体。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外快速检测胱抑素C的试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：Ⅰ制备免疫金复合物：(1)将胱抑素C单克隆抗体加入到胶体金溶液中，室温进行反应；(2)加入牛血清白蛋白以饱和游离的胶体金；(3)离心处理，离心所得沉淀用含牛血清白蛋白的缓冲液进行多次清洗，得到免疫金复合物；Ⅱ制备免疫层析试纸条：(1)将免疫金复合物喷洒在玻璃纤维素膜上制成金标垫；(2)在硝酸纤维素膜的检测线上包被胱抑素C单克隆抗体，质控线上包被羊抗鼠IgG单克隆抗体；(3)将样品垫、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次组装在PVC底板上，按需裁切成合适宽度的试纸；(4)将裁切好的试纸条装在卡壳里，压紧卡壳后即可用于检测。2.根据权利要求1所述的体外快速检测胱抑素C的试纸条的制备方法，其特征在于：所述胶体金溶液的制备方法如下：(1)将氯金酸水溶液加热至沸；(2)边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液；(3)继续加热煮沸，淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后变灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成红色后停止加热，冷却即可。3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：高玉珍，方敏敏，房钢，闫华省，
申请(专利权)人：上海方恩医疗用品有限公司，
类型：发明
国别省市：