杂合体靶向和全转录物组扩增制造技术

本文的公开内容包括用于标记核酸靶的系统、方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，该方法包括在文库制备(例如，杂合体文库制备)期间使用靶特异性引物和靶非特异性引物。在一些实施方案中，该方法在cDNA文库制备和/或测序文库制备期间增加了选择的低丰度靶的丰度。序文库制备期间增加了选择的低丰度靶的丰度。序文库制备期间增加了选择的低丰度靶的丰度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】杂合体靶向和全转录物组扩增
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求2019年2月14日提交的美国临时专利申请系列第62/805,956号的权益，该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
[0003]背景
[0004]领域
[0005]本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如使用分子条形码化(molecular barcoding)确定基因表达。
[0006]对现有技术的描述
[0007]当前的技术允许在每个细胞与隔室(compartment)中的条形码化试剂珠共定位时通过将细胞特异性寡核苷酸条形码附接到来自个体细胞的多(A)mRNA分子而以大规模平行的方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达。然而，细胞中的核酸通常处于范围为几个数量级的宽浓度范围内。这大大增加了对样品进行全面评估必需的测序或筛选的量。对在文库制备期间增加低丰度核酸丰度的系统和方法存在需求。
[0008]概述
[0009]本文的公开内容包括对核酸靶进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对核酸靶进行标记的方法，所述方法包括：(a)使多于一种核酸靶与多于一种寡核苷酸杂交，每种所述寡核苷酸包含第一通用序列和条形码序列；(b)使与所述多于一种核酸靶杂交的所述多于一种寡核苷酸延伸以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸；(c)使用所述多于一种第一链条形码化多核苷酸作为模板合成多于一种第二链条形码化多核苷酸，以产生多于一种双链条形码化多核苷酸；(d)将衔接子的序列添加到所述多于一种双链条形码化多核苷酸中，其中所述衔接子包含第二通用序列；和(e)扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸：(e1)使用能够与所述第一通用序列和所述第二通用序列杂交的引物扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸，从而产生包含所述核酸靶、所述第一通用序列、所述第二通用序列、其互补序列和/或其一部分的序列的第一多于一种条形码化扩增子，和(e2)使用能够与所述多于一种核酸靶中的两种或更多种杂交的引物扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸，从而产生包含所述多于一种核酸靶中的两种或更多种、所述第一通用序列、所述第二通用序列、其互补序列和/或其一部分的序列的第二多于一种条形码化扩增子。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括(f1)使用靶特异性引物和所述第一多于一种条形码化扩增子和/或所述第二多于一种条形码化扩增子或其产物作为模板进行延伸和/或扩增。3.根据权利要求2所述的方法，其中(f1)进行延伸和/或扩增包括将测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的结合位点的序列添加到所述第一多于一种条形码化扩增子和/或所述第二多于一种条形码化扩增子中。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，所述方法包括(f2)使用随机引物和所述第一多于一种条形码化扩增子和/或所述第二多于一种条形码化扩增子或其产物作为模板进行随机引发和延伸和/或扩增。5.根据权利要求4所述的方法，其中(f2)进行随机引发和延伸和/或扩增包括将测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的结合位点的序列添加到所述第一多于一种条形码化扩增子和所述第二多于一种条形码化扩增子或其产物中。6.根据权利要求3
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5中任一项所述的方法，其中所述测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列或其一部分。7.根据权利要求3
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6中任一项所述的方法，其中所述测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列或其一部分。8.一种对核酸靶进行标记的方法，所述方法包括：(a)使多于一种核酸靶与多于一种寡核苷酸杂交，每种所述寡核苷酸包含第一通用序列和条形码序列；(b)使与所述多于一种核酸靶杂交的所述多于一种寡核苷酸延伸以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸；(c)使用所述多于一种第一链条形码化多核苷酸作为模板合成多于一种第二链条形码
化多核苷酸，以产生多于一种双链条形码化多核苷酸；(d)将衔接子的序列添加到所述多于一种双链条形码化多核苷酸中，其中所述衔接子包含第二通用序列；(e1)使用能够与所述第一通用序列和所述第二通用序列杂交的引物扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸，从而产生包含所述核酸靶、所述第一通用序列、所述第二通用序列、其互补序列和/或其一部分的序列的第一多于一种条形码化扩增子；(f1)使用靶特异性引物和所述第一多于一种条形码化扩增子或其产物作为模板进行延伸和/或扩增。9.根据权利要求8所述的方法，所述方法包括(f2)使用随机引物和所述第一多于一种条形码化扩增子或其产物作为模板进行随机引发和延伸和/或扩增。10.根据权利要求9所述的方法，其中(f2)进行随机引发和延伸和/或扩增包括将测序衔接子的序列添加到所述第一多于一种条形码化扩增子或其产物。11.根据权利要求8
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10中任一项所述的方法，其中(f1)进行延伸和/或扩增包括将测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的结合位点的序列添加到所述第一多于一种条形码化扩增子中。12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列或其一部分。13.根据权利要求10
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12中任一项所述的方法，其中所述测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列或其一部分。14.根据权利要求8
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13中任一项所述的方法，所述方法包括(e2)使用能够与所述多于一种核酸靶中的两种或更多种杂交的引物扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸，从而产生包含所述多于一种核酸靶中的两种或更多种和/或其一部分的序列的第二多于一种条形码化扩增子。15.根据权利要求1
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13中任一项所述的方法，其中(e2)使用能够与所述多于一种核酸靶中的两种或更多种杂交的引物扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸包括使用能够与所述多于一种核酸靶中的两种或更多种杂交的引物和能够扩增所述第一通用序列的引物扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸。16.根据权利要求1
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13中任一项所述的方法，其中(e2)使用能够与所述多于一种核酸靶中的两种或更多种杂交的引物扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸包括使用能够与所述多于一种核酸靶中的两种或更多种杂交的引物和能够扩增所述第二通用序列的引物扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中(b)延伸所述多于一种寡核苷酸以产生所述多于一种第一链条形码化多核苷酸包括对所述多于一种核酸靶中的一种或更多种核酸靶进行逆转录。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多于一种第一链条形码化多核苷酸包括条形码化单链cDNA分子。19.根据权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中(b)延伸所述多于一种寡核苷酸以产生所述多于一种第一链条形码化多核苷酸包括对与所述多于一种核酸靶的一种或更多种核酸靶杂交的所述多于一种寡核苷酸中的一种或更多种寡核苷酸进行核酸延伸。
20.根据权利要求1
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19中任一项所述的方法，其中所述衔接子的序列被添加到所述多于一种双链条形码化多核苷酸的5
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末端、3
’
末端或二者。21.根据权利要求1
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20中任一项所述的方法，所述方法包括(g)获得所述第一多于一种条形码化扩增子和/或所述第二多于一种条形码化扩增子或其产物的序列信息。22.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种条形码化扩增子包含全转录物组扩增(WTA)产物。23.根据权利要求1
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22中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种条形码化扩增子对应于单细胞的mRNA的至少10％、至少50％或至少90％。24.根据权利要求1
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23中任一项所述的方法，其中所述第二多于一种条形码化扩增子对应于单细胞的mRNA的至多5％、至多10％或至多20％。25.根据权利要求1
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24中任一项所述的方法，其中所述衔接子是单链多核苷酸。26.根据权利要求1
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25中任一项所述的方法，其中所述衔接子是双链多核苷酸。27.根据权利要求1
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26中任一项所述的方法，其中所述衔接子或所述衔接子的链的长度是2
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30个核苷酸。28.根据权利要求1
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27中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列和所述第二通用序列是相同的。29.根据权利要求1
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27中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列和所述第二通用序列是不同的。30.根据权利要求1
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29中任一项所述的方法，其中所述多于一种扩增子中的每一种包含以下的至少一部分：所述第一通用序列、所述第二通用序列或二者。31.根据权利要求1
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30中任一项所述的方法，其中(d)将所述衔接子的序列添加到所述多于一种双链条形码化多核苷酸包括将所述衔接子连接到所述多于一种双链条形码化多核苷酸。32.根据权利要求1
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30中任一项所述的方法，其中(d)将所述衔接子的序列添加到所述多于一种双链条形码化多核苷酸中包括通过核酸延伸或扩增将所述衔接子的序列添加到所述多于一种双链条形码化多核苷酸中，任选地，其中所述扩增包括聚合酶链式反应。33.根据权利要求1
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32中任一项所述的方法，其中扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸包括通过线性扩增来扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸，任选地，其中所述线性扩增包括1
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100个循环的扩增。34.根据权利要求1
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33中任一项所述的方法，其中扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸包括通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增所述多于一种双链条形码化多核苷酸，任选地，其中所述PCR包括1
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100个循环的PCR。35.根据权利要求1
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34中任一项所述的方法，其中(f1)进行所述延伸和/或扩增包括进行1
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100个循环的延伸和/或扩增，任选地其中所述扩增包括聚合酶链式反应(PCR)扩增。36.根据权利要求1
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35中任一项所述的方法，其中(f2)进行随机引发和延伸和/或扩增包括进行1
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100个循环的随机引发和延伸和/或扩增，任选地其中所述扩增包括聚合酶链式反应(PCR)扩增。37.一种对核酸靶进行标记的方法，所述方法包括：(a)使多于一种核酸靶与多于一种寡核苷酸杂交；
(b)将所述多于一种寡核苷酸在存在逆转录酶和模板转换寡核苷酸(TSO)的情况下延伸，以产生包含所述TSO或其一部分的多于一种第一链条形码化多核苷酸，其中所述多于一种寡核苷酸中的每一种和/或所述模板转换寡核苷酸包含第一通用序列和条形码序列；(c)扩增所述多于一种第一链条形码化多核苷酸，(c1)使用能够与所述第一通用序列和所述TSO或其一部分杂交的引物扩增所述多于一种第一链条形码化多核苷酸，以合成第一多于一种第二链条形码化多核苷酸并且产生第...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾琳，
申请(专利权)人：贝克顿迪金森公司，
类型：发明
国别省市：