适用于高通量单细胞转录测序的前处理方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种适用于高通量单细胞转录测序的前处理方法。本发明专利技术所提供的处理方法同时将数千个PBMC细胞有效分离到芯片上的微孔结构中，使PBMC细胞和Barcode Beads在同一个微孔中，并给每一个细胞加上独特的分子标签单次检测数量可以达到1000~10000个细胞，可以在室温状态下实现海量PBMC单细胞检测。即便细胞数量过万仍具有较高的准确率，实现高通量PBMC单细胞转录测序，且检测结果准确。本发明专利技术所提供的方法简便，可手动操作，无需特殊仪器，适用于不同细胞类型，具有广谱性。有广谱性。有广谱性。

【技术实现步骤摘要】
适用于高通量单细胞转录测序的前处理方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种适用于高通量单细胞转录测序的前处理方法。

技术介绍

[0002]外周血单个核细胞（PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，其包含了人外周血的各种免疫细胞，人血中能够分泌免疫细胞因子的各类主要细胞都包含其中。其主要为淋巴细胞和单核细胞；淋巴细胞约为88%、单核细胞约为12%。目前，人类免疫系统功能研究极其依赖PBMC的表型和功能评估，因此对外周血各类亚群的表型和功能、PBMC与组织免疫细胞的不同进行充分了解是非常必要的。由于PBMC直径较小，通常在10μm左右，所含有的RNA和基因数都偏少，且RNA易降解，因此采用常规实验方法难以捕获到完整RNA进行后续的单细胞转录组测序。
[0003]目前，常用的PBMC转录组测序前处理方法均对细胞数有限制，检测通量较小，一次只能捕获几百到几千个细胞，而且后续实验过程繁琐，或是当检测细胞数超过1万个以后容易导致doublet从而影响数据质量，造成细胞中RNA降解，不能实现海量PBMC单细胞测序。因此，仍需要对现有的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量单细胞转录测序前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将PBMC细胞悬液注入微流控芯片中，通过微孔分离单个细胞，使每个孔中得到一个细胞；（2）将能够捕获RNA的Barcode Beads注入微流控芯片中，使PBMC细胞和Barcode Beads在同一个微孔中；（3）向微流控芯片中注入细胞裂解液，使细胞裂解释放出mRNA，释放出的mRNA被 Barcode Beads捕获；（4）捕获完成后，取出带有mRNA的Barcode Beads，用反转录试剂进行反转录，合成cDNA第一链；（5）反转录完成后的产物，用PCR试剂进行扩增反应，得到双链DNA，构建测序文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述PBMC悬液的细胞浓度为1
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5 cells/mL，细胞活性大于90%，细胞体积不少于500μL。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述微流控芯片的微孔数为1000~80000个。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述同一个微孔为每个微孔中同时含有一个PBMC细胞和一个能捕获RNA引物的Barcode Beads。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述细胞裂解液的组成成分中含有终浓度为0.1~0.5 mol/L 的Tris
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Hcl，终浓度为0.5~1 mol/L 的Licl，0.01~2% 的Triton X100，终浓度为5mmol/L 的DTT，终浓度为10mmol/L的EDTA。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的细胞裂解液的组成成分中含有终浓度为0.3~0.5的 mol/L Tris
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Hcl，终浓度为0.8~1 mol/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：訾晓渊，雷佳，
申请(专利权)人：南京通元医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：