一种用于靶向FFPERNA建库的方法技术

技术编号:29968135 阅读:24 留言:0更新日期:2021-09-08 09:40
本发明专利技术提供一种用于靶向FFPE RNA建库的方法,其步骤包括:对样本进行FFPE RNA的片段化,使FFPE RNA大小主要集中到150~200bp;在片段化后的FFPE RNA末端添加poly(A)多聚核酸;使用逆转录酶,以末端加A的FFPE RNA为模板,进行1st cDNA的合成;对合成的1st cDNA进行靶向区域基因的富集处理;文库扩增。本发明专利技术方法是利用带有接头序列的特定引物直接在1st cDNA上进行目标区域的扩增,然后通过PCR实现完整的测序文库,直接对目标区域进行扩增建库测序使得目标区域更集中,建库流程较为简单,时间短,数据利用率高,成本低。成本低。成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种用于靶向FFPE RNA建库的方法


[0001]本专利技术专利涉及一种用于靶向FFPE RNA建库的方法。

技术介绍

[0002]经过福尔马林固定,蜡块包埋后的肿瘤组织的FFPE样本是临床研究的重要资源,可以用于组织学诊断,还能进行NGS测序分析基因表达,可变剪接融合基因等信息。但是福尔马林和蛋白交联会影响核酸的提取,抑制聚合酶等活性,高温渗入的石蜡会降低核酸的质量。而且RNA相比DNA更容易降解,因此FFPE RNA的完整性差,品质低。总RNA中约有90%是核糖体RNA(rRNA),因此FFPE RNA样本的RNA

seq面临严峻的挑战。
[0003]对于FFPE RNA样本的RNA

seq建库策略一般时间较长,大约8~10h,要经过rRNA的去除,然后再进行RNA的片段化、1st cDNA合成、2nd cDNA的合成、末端修复、接头连接及文库扩增等过程复杂。通常还要进行捕获测序才能得要研究者想要的遗传信息,因此需要较高的测序量。这样的建库策略耗时长,成本高,对样本的质量和投入量等有较高要求本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于靶向FFPERNA建库的方法,其步骤包括:(1)FFPERNA的片段化;(2)片段化的FFPERNA的3
´
末端加poly(A)多聚核酸;(3)1
st
cDNA的合成;(4)靶向区域基因的富集扩增;(5)文库扩增。2.根据权利要求1所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(1)FFPERNA的片段化,将FFPERNA片段化到150~200bp。3.根据权利要求2所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(2)中片段化的FFPERNA的3
´
末端加poly(A)多聚核酸使用的是Poly(A)聚合酶。4.根据权利要求1

5中任一项所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(2)中在37℃10min完成FFPERNA末端添加27~33个poly(A)。5.根据权利要求5所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(2)中使用的1XPoly(A)PolymeraseReactionBuffer为50mMTris

HCl,250mMNaCl,10mMMgCl2,pH8.1。6.根据权利要求1所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(3)中1
st
cDNA的合成体系包括:步骤(2)得到的FFPERNA片段、buffer、dNTP、Oligo

dt30v引物、T

Primer引物、逆转录酶和MurineRNaseInhibitor鼠源RNase抑制剂,其中Oligo

dt30v引物序列为:5
´‑
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV
‑3´
,T

Primer引物序列为:5
´‑‑
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGr+G
‑3´
。7.T

Primer引物末端进行锁核酸修饰根据权利要求2所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(3)中1stcD...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘娜戴广伟卢瑶曹振宋东亮
申请(专利权)人:翌圣生物科技上海股份有限公司
类型:发明
国别省市:

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