【技术实现步骤摘要】
一种用于靶向FFPE RNA建库的方法
[0001]本专利技术专利涉及一种用于靶向FFPE RNA建库的方法。
技术介绍
[0002]经过福尔马林固定,蜡块包埋后的肿瘤组织的FFPE样本是临床研究的重要资源,可以用于组织学诊断,还能进行NGS测序分析基因表达,可变剪接融合基因等信息。但是福尔马林和蛋白交联会影响核酸的提取,抑制聚合酶等活性,高温渗入的石蜡会降低核酸的质量。而且RNA相比DNA更容易降解,因此FFPE RNA的完整性差,品质低。总RNA中约有90%是核糖体RNA(rRNA),因此FFPE RNA样本的RNA
‑
seq面临严峻的挑战。
[0003]对于FFPE RNA样本的RNA
‑
seq建库策略一般时间较长,大约8~10h,要经过rRNA的去除,然后再进行RNA的片段化、1st cDNA合成、2nd cDNA的合成、末端修复、接头连接及文库扩增等过程复杂。通常还要进行捕获测序才能得要研究者想要的遗传信息,因此需要较高的测序量。这样的建库策略耗时长,成本高,对样本的质量 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于靶向FFPERNA建库的方法,其步骤包括:(1)FFPERNA的片段化;(2)片段化的FFPERNA的3
´
末端加poly(A)多聚核酸;(3)1
st
cDNA的合成;(4)靶向区域基因的富集扩增;(5)文库扩增。2.根据权利要求1所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(1)FFPERNA的片段化,将FFPERNA片段化到150~200bp。3.根据权利要求2所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(2)中片段化的FFPERNA的3
´
末端加poly(A)多聚核酸使用的是Poly(A)聚合酶。4.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(2)中在37℃10min完成FFPERNA末端添加27~33个poly(A)。5.根据权利要求5所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(2)中使用的1XPoly(A)PolymeraseReactionBuffer为50mMTris
‑
HCl,250mMNaCl,10mMMgCl2,pH8.1。6.根据权利要求1所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(3)中1
st
cDNA的合成体系包括:步骤(2)得到的FFPERNA片段、buffer、dNTP、Oligo
‑
dt30v引物、T
‑
Primer引物、逆转录酶和MurineRNaseInhibitor鼠源RNase抑制剂,其中Oligo
‑
dt30v引物序列为:5
´‑
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV
‑3´
,T
‑
Primer引物序列为:5
´‑‑
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGr+G
‑3´
。7.T
‑
Primer引物末端进行锁核酸修饰根据权利要求2所述的用于靶向FFPERNA建库的方法,其特征在于:步骤(3)中1stcD...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘娜,戴广伟,卢瑶,曹振,宋东亮,
申请(专利权)人:翌圣生物科技上海股份有限公司,
类型:发明
国别省市:
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。