【技术实现步骤摘要】
一种整体免疫后双固定包埋制样法
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[0001]本专利技术属于透射电子显微镜领域,具体涉及一种整体免疫后双固定包埋制样法。
技术介绍
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[0002]透射电子显微镜是现有分辨率最高的显微镜。利用透射电镜不仅可以观察组织的超微结构,结合酶定位、离子定位、免疫纳米金标记技术,则可以得知预期的酶、特定离子、抗原(多数时候是蛋白)在细胞器中的分布情况。
[0003]透射电子显微镜要求样品非常薄,且不含水,所以生物组织通常需要经历醛固定
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四氧化锇固定
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脱水
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包埋
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超薄切片
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重金属染色的过程才能放入透射电子显微镜中观察。常规的免疫标记技术,则是在超薄切片制成后用一抗结合抗原,再用含有纳米金颗粒的二抗结合一抗。金颗粒成像为黑圆点与组织成像结果不同,从而可以得到抗原在细胞中的分布情况(标记抗原得到其定位信息)。因为醛基固定液中的戊二醛及四氧化锇会使抗原完全变性,无法与一抗结合,所以后续需要做免疫金标记的样品在制备过程中,往往不使用戊二醛及四氧化锇这两种固定剂,通过牺牲组织结构的固定效果来保证抗原活性。但是固定是样品制备中非常关键的步骤,目的是终止细胞的生化过程,稳定细胞物质成分,保持生活细胞原来的微细构造,避免细胞自溶和因外界微生物的入侵而产生腐败,造成假像出现,以及在一些组分的分子之间以化学反应或物理反应建立交联,以提供一个骨架来稳定各种细胞器的空间构型,而且固定剂四氧化锇还可以提高图像反差效果。由于只使用多聚甲醛这种固定剂,所 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种整体免疫后双固定包埋制样法,其特征在于,是在透射电子显微镜样品常规制样的前面,先让一抗二抗结合抗原,然后再进行透射电子显微镜样品制样。2.根据权利要求1所述的整体免疫后双固定包埋制样法,其特征在于,在一抗二抗结合抗原之前用离析酶和/或Triton
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100处理固定后的材料,使得材料的细胞壁和细胞膜上打开通道。3.根据权利要求2所述的整体免疫后双固定包埋制样法,其特征在于,所述的在一抗二抗结合抗原之前用离析酶和/或Triton
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100处理固定后的材料的具体步骤为:将组织切成块,固定,磷酸缓冲液清洗后的材料置于离析酶酶解液中消化,然后清洗,再置于TritonX
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100溶液中处理,再用磷酸缓冲液清洗。4.根据权利要求3所述的整体免疫后双固定包埋制样法,其特征在于,所述的离析酶是质量分数0.15%离析酶,所述的TritonX
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100溶液是质量分数0.1%~0.2%的TritonX
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100溶液。5.根据权利要求1所述的整体免疫后双固定包埋制样法,其特征在于,具体步骤为:a、将组织切成块,用质量分数4%的多聚甲醛固定,再用质量分数0.15%离析酶酶解液消化细胞壁,质量分数1%脱脂奶粉浸泡封闭材料,然后先后进行一抗、二抗的孵育;b、孵育后的材料先后用含质量分数2%的多聚甲醛和质量分数2.5%戊二醛的溶液固定、质量分数1%的四氧化锇固定,固定后的材料经清洗后,再经脱水、过渡、渗透、包埋、聚合,得到环氧树脂包埋块。6.根据权利要求1或5所述的整体免疫后双固定包埋制样法,其特征在于,具体步骤为:a、第一次固定:组织切成小块,最大厚度不大于500微米,放置于质量分数4%的多聚甲醛的磷酸缓冲液溶液抽气保存2小时,4℃;b、第一次清洗:将固定后的材料用磷酸缓冲液清洗5次,每次5min,4℃;c、消化细胞壁:磷酸缓冲液配置含质量分数0.15%离析酶酶解液,将步骤b的组织块置于酶解液中,室温消化材料45min,之后用4℃...
【专利技术属性】
技术研发人员:邓汝芳,刘旭,陈雅平,刘乐如,徐信兰,贾永霞,胡晓颖,
申请(专利权)人:中国科学院华南植物园,
类型:发明
国别省市:
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