从具有非磁性生物材料的悬浮液中分离所需细胞的方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及一种用于从含有包括所需和不需要的细胞的生物材料的异质性样品溶液中分离非磁性细胞的方法和装置。该方法包括以下步骤：

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从具有非磁性生物材料的悬浮液中分离所需细胞的方法和装置


[0001]本专利技术涉及一种用于从非磁性生物材料样品中分离所需细胞的方法和装置。

技术介绍

[0002]在生物医学研究领域，各种分析方法经常需要从异质性颗粒悬浮液中纯化生物材料。人们对富集细胞和单细胞生物(包括细菌和病毒)以及细胞片段(例如蛋白质、肽或核酸)非常感兴趣。
[0003]为简单起见，术语“细胞”在本文中以最广泛的含义使用，并代表所有多细胞和单细胞生物，但也包括细胞碎片和病毒，以及单个生物分子，例如蛋白质、肽或核酸。
[0004]为了改进分离或产生难以分离或分离不充分的生物材料的可分离性，有多种标记方法可用，并且通常基于所谓的亲和反应。最常见的分离技术基于用荧光染料或合成磁性颗粒标记靶细胞或细胞碎片。与所谓的荧光激活细胞分选相比，所谓的磁性细胞分离技术因其简单性和成本而脱颖而出。
[0005]磁分离过程是通过分别用受体或配体缀合的磁性颗粒标记靶材料来进行的。术语靶材料应表示可能与生物材料结合形成特定结合对的所有物质和分子结构。
[0006]术语特异性结合对代表表现出结合趋势的物质对或组合，包括细胞成分、生物特异性配体和受体等要素。从这个意义上说，靶材料的标记是通过由配体和受体组成的特定结合对的结合来进行的。术语“配体”表示与靶材料结合的成分，能够特异性结合并包含由至少一个表位或其他特征决定簇限定的抗原或半抗原。术语“受体”表示对专属配体具有生物特异性亲和力的标记靶标或其组。可能的受体可以是单克隆抗体或其片段、特异性结合蛋白例如蛋白A或G、生物素链霉亲和素结合对、适体、核酸等。优选地，认为高结合动力学和可能的可逆性，生物特异性结合本质上是非共价的。
[0007]我们应参考专利US4,884,088、US4,654,267、US4,452,773和US5,597,531中对适用于磁性细胞分离技术的磁性颗粒的最新制备技术的描述。此后，颗粒核心由磁性材料组成，例如磁铁矿和铁磁性氧化铁。产生所谓的顺磁行为需要至少30nm的晶粒尺寸。由于仅在受外部磁场影响时的高磁极化，此类磁性材料通常被称为磁敏感、可磁化或超顺磁性。由于残余磁性微不足道，这种磁性防止在磁分离过程中和之后的颗粒聚集。此外，磁性颗粒成分部分地决定了所谓的富集效率。磁性颗粒具有最大磁化率，其受颗粒核心中铁磁晶体的数量和尺寸控制。
[0008]一般来说，磁分离技术可分为内部过程和外部过程(intrinsic and external procedures)。如前所述，在存在外部磁场源的情况下，小于100nm的磁性颗粒仅产生非常小的磁矩。然而，小的颗粒尺寸与反应性表面和颗粒体积或颗粒数量之间的有利比率有关。因此，使用直径范围在30nm和100nm之间的所谓纳米颗粒，所谓的高梯度磁性分离系统是磁性分级所必需的，并且已在例如专利US 4,664,796、US 5,200,084、WO 96/26782A和EP 0 942766A中描述。
[0009]Miltenyi AG公司开发了用于通用细胞分离的市售内在细胞分离系统，该系统采用直径测量为50nm的磁性纳米颗粒。因此，正在使用所谓的磁性分选柱，该柱由置于非磁性容器中的铁磁性基体组成。为了进行磁分离，将分选柱引入强外磁场中。预计分选腔内的高磁场梯度可测量达100特斯拉/cm。与阻止快速方案、阻碍自动化和增加成本的外部磁性分离过程相比，该过程是复杂的。此外，磁性分离基体会产生高反应性表面积，这可能会对活细胞产生压力或增加细胞与反应性表面的非特异性结合。
[0010]为了避免磁性分选柱的缺点并享受使用纳米颗粒的好处，已经开发了外部高梯度磁分离系统。因此，重点放在外部专用磁体配置上，例如专利US 5,186,827中描述的四极或六极配置。这种磁体产生的场梯度范围为1.5特斯拉/cm，但需要更大的磁性颗粒，其尺寸(直径)范围为150nm到4μm。
[0011]使用直径超过500nm的磁性粒子允许使用非常简单且成本较低的磁体分离装置，从而将培养容器相邻于简单的永磁体放置。市售系统由例如Dynal Inc.提供，名为Dynal MPC1。
[0012]推进基于磁性颗粒的分离系统的一个主要方面是提高富集质量，主要是减少所需细胞的损失并使其纯度最大化。富集过程通常包括用于靶材料磁性标记的孵育阶段和随后的磁性分离。通常，当使用不超过150nm的颗粒时，孵育是在静止状态下进行的，或者在使用具有沉淀倾向的较大颗粒的情况下偶尔混合。
[0013]专利DE 10 2015 013 851中描述了一种磁性标记过程，其中在存在磁场和孵育容器旋转的情况下将颗粒与生物材料一起孵育。与静置孵育相比，该过程显示出产出更高的磁性标记效率，并且在更短的时间间隔内与更高数量的靶结合磁性粒子相关。后来，Schreier et.al 2017提出了"动态磁性标记"这一术语，以描述与静止状态下相当被动的孵育相比，磁性标记的一种主动形式。人们怀疑在存在磁场的情况下孵育容器的旋转会迫使和增加粒子与靶材料的碰撞，从而加速反应动力学。术语“碰撞行为”应定义负责在相似和不同类型的反应对之间产生各种结合的运动模式。一般来说，碰撞行为可以用一个磁性颗粒的线性矩、两个相等或两个不同反应对之间每个时间间隔的碰撞频率或数量、一个反应物与其他不同反应物在一定孵育时间内和反应对之间接触的持续时间内的碰撞总和来表征。
[0014]制药和生物医学研究和开发特别感兴趣的是从异质性细胞悬浮液中分离稀有细胞。因此，例如，血液样本中某些稀有细胞或稀有细胞群的分离、定量和表征可以实时帮助独立和快速提供病理诊断。感兴趣的一个方面是所谓的循环肿瘤细胞(CTC)的富集，特别是在癌症、黑色素瘤或肉瘤患者的外周静脉血中检测CTC。CTC可能有潜力作为独立的早期癌症生物标志物，在某些情况下可能会取代组织活检的侵入性研究。
[0015]将循环稀有细胞(CRC)作为生物标志物转化为临床实践的一个主要问题是低效的分离和选择。在依靠磁分离技术时，可以在阳性选择(positive selection)和阴性选择(negative selection)之间进行选择。当进行阳性选择时，所需细胞被磁标记，而在阴性选择中，不需要的细胞被磁标记。阴性选择具有受体独立性或换句话说对特定细胞类型的低选择性的优点，因此，当面对具有未知或高度可变的所需细胞群的细胞混合物时，阴性选择是更好的选择，从而提高灵敏度。
[0016]术语“富集困境(enrichment dilemma)”表示富集不足的问题，特别是与稀有细胞
的分离有关。富集不足意味着需要高纯度但仅以分析物的显著损失为代价来实现。相比之下，稀有意味着要求只有通过接受低纯度才能达到的没有损失或低水平的损失分析物。富集效率以log数衡量，表示富集前后分别的分析物纯度之间的比率。从血液中分离稀有细胞，纯度应与有核细胞有关，不包括红细胞和血小板。因此，例如，假设每毫升6
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106白细胞，1ml(毫升)血液中10个稀有细胞的纯度为0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从含有生物材料的异质性样品溶液中分离非磁性细胞的方法，所述生物材料包括所需细胞和不需要的细胞，所述方法包括以下步骤：
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向样品溶液中添加磁性或可磁化颗粒，其中所述颗粒具有100nm至4μm范围内的尺寸并且表现出支持与靶细胞特异性结合的表面成分，其中所述靶细胞包括所述所需细胞或所述不需要的细胞；
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将所述样品溶液与所述磁性颗粒一起孵育以获得磁化细胞级分；
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使用洗涤溶液洗涤所述磁化细胞级分以减少非特异性结合；
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从所述样品中分离靶细胞的所述磁化细胞级分；其中所述样品溶液在整个所述添加、孵育、洗涤和分离步骤中经受外部磁场梯度，并且其中所述样品溶液至少在所述添加、孵育和洗涤步骤期间旋转。2.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：
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在所述添加步骤之前建立外部磁场梯度；
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在所述添加步骤之后和所述孵育步骤之前降低所述外部磁场梯度；
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在所述分离步骤之前增加所述外部磁场梯度。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品溶液提供在样品容器中，所述样品容器在所述添加、孵育和洗涤步骤期间以不同速度同心旋转。4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中孵育步骤由几个孵育循环组成，其中每个孵育循环包括；
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为了产生磁性颗粒结合的细胞级分，在添加颗粒期间以慢于快速旋转速度的孵育容器的低速旋转速度进行磁性标记步骤；和
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混合步骤，以在所述磁性标记步骤后在所述异质性样品悬浮液中建立均等分布。5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述磁性标记步骤和所述混合步骤之间进一步降低所述磁场梯度，并且如果重复孵育循环，则在随后的标记步骤之前再次增加。6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中洗涤步骤包括一个或多个洗涤循环，其中每个洗涤循环包括以下步骤：
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从磁分离的细胞级分中去除上清液；
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在低或不含蛋白质的等渗洗涤溶液中，在存在弱磁场梯度下，重新悬浮磁分离的细...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：S，
类型：发明
国别省市：