一种猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，该方法是利用3种不同颜色编号标记的TaqMan荧光探针，分别标记猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌的特异性基因探针，使得该方法能够在一个反应中实现同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌靶基因的检测方法，该方法检测灵敏度高，特异性好，操作简便，临床上具有极高的应用价值。临床上具有极高的应用价值。临床上具有极高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及病菌检测
，具体为一种猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，MHP)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App)是猪常见的3种呼吸道病原菌，分别引起猪传染性胸膜肺炎、猪肺疫等，导致猪呼吸道的急慢性炎症，引起高死亡率、低增重率以及治疗成本增加等。呼吸系统疾病是现代养猪生产中面临的最严重的问题之一，且这3种病原菌混合感染十分普遍，引起的临床症状也很难区分，不仅提高了猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度，也增加了疾病的复杂性和诊断难度。因此，建立一种能同时快速检测这3种病原菌的诊断方法十分必要。
[0003]目前，以实时荧光定量PCR技术为基础的核酸诊断方法是国内应用最为广泛的方法之一，该方法的原理主要基于标记不同颜色Taq
‑
Man荧光探针。现有的猪病相关的核酸检测试剂盒大多采用单重或双重荧光探针方法实现靶基因的快速诊断。本专利技术采用三重荧光定量PCR技术，在同一反应体系中加入3条不同颜色标记的荧光探针，可以实现在一管反应中同时检测3个靶基因的目的，其通量高，检测速度快，同时本专利技术可以实现反应液与酶液预混，使用时只需打开八联管盖，将提取好的核酸样本加入对应反应管即可上级检测，大量节省了临床操作流程，也极大的降低了交叉污染的概率，是目前临床所需的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，试剂盒包括引物组，引物组的核苷酸序列如下所示：
[0005]猪肺炎支原体引物：
[0006]MHPF2：5'
‑
GATATTAAATCTGGATTTTTC
‑
3'，
[0007]MHPR2：5'
‑
ATTGTATTTACCAAAGTCATA
‑
3'；
[0008]猪多杀性巴氏杆菌引物：
[0009]SAPF2：5'
‑
TCTCTTCATTATTAGTTGCAT
‑
3'，
[0010]SAPR1：5'
‑
ACTATTTGATTGAACCGGTT
‑
3'；
[0011]猪胸膜肺炎放线杆菌引物：
[0012]APPF3：5'
‑
GGTATTGAACCTCTTGGTAA
‑
3'，
[0013]APPR2：5'
‑
GTCGATAATACTTTCCAAAC
‑
3'；
[0014]试剂盒还包括探针，探针核苷酸序列如下所示：
[0015]猪肺炎支原体探针：
[0016]MHPP1：5'
‑
ACAAGAGATCCAGTCATACCAAGGCA
‑
3'；
[0017]猪多杀性巴氏杆菌探针：
[0018]SAPP1：5'
‑
TTCCTACACGGTCAGCACGATTTC
‑
3'；
[0019]猪胸膜肺炎放线杆菌探针：
[0020]APPP1：5'
‑
ACTAAGTTAGACCAAAAGCCGCC
‑
3'。
[0021]优选的，所述探针中还标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TEXAS RED、ROX、CY3和CY5中的一种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种；不同探针标记的荧光基团各不相同。
[0022]本专利技术还提供了一种猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒的检测方法，包含以下步骤：
[0023]1)提取样本DNA；
[0024]2)以提取的DNA作为模板，使用引物组MHPF2、MHPR2、SAPF2、SAPR1、APPF3、APPR2，以及使用探针MHPP1、SAPP1和APPP1进行三重荧光定量PCR扩增反应获得扩增产物；
[0025]3)对扩增曲线进行曲线分析，确定样品中是否含有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌。
[0026]优选的，步骤2)中的荧光定量PCR扩增反应体系为：
[0027]2.5mM/μL dNTPmix为2μL，5
×
PCR buffer为5μL，50pmol/μL引物MHPF2为0.1μL，50pmol/μL引物MHPR2为0.1μL，50pmol/μL引物SAPF2为0.1μL，50pmol/μL引物SAPR1为0.1μL，50pmol/μL引物APPF3为0.2μL，50pmol/μL引物APPR2为0.2μL，50pmol/μL探针MHPP1为0.05μL，50pmol/μL探针SAPP1为0.08μL，50pmol/μL探针APPP1为0.15μL，酶液为1μL，ddH2O补至20μL，DNA模板/阳性对照/阴性对照为5μL。
[0028]优选的，步骤2)的三重荧光定量PCR反应程序为：42℃
‑
50℃逆转录10
‑
30min，1个循环；93～95℃预变性2～10min，1个循环；93～95℃变性5～30s，55～60℃退火、延伸、信号采集30～60s；循环40～45次。
[0029]优选的，PCR buffer包含250mM的tris
‑
base，0.25％的TritonX
‑
100，25mM的MgCl2，2.5％甘油。
[0030]优选的，酶液包含抗体修饰热启动酶DNA聚合酶和酶保存液。
[0031]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：能够实现快速准确的对样本中猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的快速筛查。其操作简单、准确性高、特异性好，重复性好，有利于在临床实践中推广应用。
附图说明
[0032]图1是猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的三重荧光定量PCR试剂盒阳性标准品10倍稀释梯度系列样品的扩增曲线图；
[0033]图2是猪肺炎支原体的FAM通道定量标准曲线图；
[0034]图3是猪多杀性巴氏杆菌的HEX通道定量标准曲线图；
[0035]图4是猪胸膜肺炎放线杆菌的CY5通道定量标准曲线图；
[0036]图5是本专利技术方法对阳性对照样品的扩增结果图；
[0037]图6是本专利技术方法对阴性对照样本的扩增结果图；
[0038]图7是本专利技术方法对10个样本的扩增检测结果图。
具体实施方式
[0039]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术进行进一步详本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括引物组，引物组的核苷酸序列如下所示：猪肺炎支原体引物：MHPF2：5'
‑
GATATTAAATCTGGATTTTTC
‑
3'，MHPR2：5'
‑
ATTGTATTTACCAAAGTCATA
‑
3'；猪多杀性巴氏杆菌引物：SAPF2：5'
‑
TCTCTTCATTATTAGTTGCAT
‑
3'，SAPR1：5'
‑
ACTATTTGATTGAACCGGTT
‑
3'；猪胸膜肺炎放线杆菌引物：APPF3：5'
‑
GGTATTGAACCTCTTGGTAA
‑
3'，APPR2：5'
‑
GTCGATAATACTTTCCAAAC
‑
3'；试剂盒还包括探针，探针核苷酸序列如下所示：猪肺炎支原体探针：MHPP1：5'
‑
ACAAGAGATCCAGTCATACCAAGGCA
‑
3'；猪多杀性巴氏杆菌探针：SAPP1：5'
‑
TTCCTACACGGTCAGCACGATTTC
‑
3'；猪胸膜肺炎放线杆菌探针：APPP1：5'
‑
ACTAAGTTAGACCAAAAGCCGCC
‑
3'。2.根据权利要求1所述的一种猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述探针中还标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TEXASRED、ROX、CY3和CY5中的一种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种；不同探针标记的荧光基团各不相同。3.一种根据权利要求1所述的猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包含以下步骤：1)提取样本DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄健，田华，
申请(专利权)人：江西中科基因检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：