一种非洲猪瘟病毒抗体的血清学检测方法技术

本发明专利技术涉及一种非洲猪瘟血清抗体IPMA检测试剂及其制备方法，所述检测试剂中非洲猪瘟病毒选择非洲猪瘟减毒株(HLJ/18

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒抗体的血清学检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及病毒检测


技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起猪的一种急性、烈性和高度传染性疾病，目前尚未有商品化预防用疫苗和有效的治疗性药物。非洲猪瘟病毒属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是该属目前的唯一成员。ASFV主要感染家猪、野猪，临床症状与经典猪瘟(Classical swine fever,CSF)相似，以持续性发热为主，猪只表现为食欲减退或消失，呼吸困难。猪只感染ASFV后通常会急性死亡，死亡率高达100％。2016年至2020年，全球共发生14327起ASF疫情，损失820万头猪。据不完全统计，自2018年疫情在我国爆发以来，国内报道的ASF疫情已达188起，扑杀生猪超过120万头，给我国养猪业造成了严重的损失。如今ASF严重威胁到了我国乃至世界的猪肉生产和粮食安全，是世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties, OIE)高度关注与持续监控的传染病，中国将其列为一类动物疫病。
[0003]ASFV是目前唯一发现的通过节肢动物作为媒介传播的一种双链核质大DNA病毒 (nucleocytoplasmic large DNA viruses,NCLDV)。其病毒粒子呈正20面体的多层结构，由内到外分别是核仁、蛋白质核壳、脂质包膜以及最外层的蛋白质衣壳。通过冷冻电子显微镜对ASFV进行结构分析，表明ASFV粒子直径在260
‑
300纳米之间，其蛋白质外壳由主要衣壳蛋白(p72)和四种次要衣壳蛋白(M1249,P17,P49和H240R)构成。ASFV基因组长度约为170
‑
190Kbp，可以编码151
‑
167个开放阅读框(Opening Reading Frames，ORF)。
[0004]常用的非洲猪瘟病毒的检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、血清中和试验、免疫荧光技术、聚合酶链式反应(PCR)、核酸探针和基因芯片等。这些方法具有很好的特异性、灵敏性和高效性，但其费用相对高，设备要求也较高，不利于基层和临床推广。
[0005]血清学方法是流行病学监测的重要内容和防控策略制定的重要依据，特别是对ASF耐过猪、ASF弱毒株感染猪(临床症状轻微，不易被发现)的检测具有重要意义，同时一旦商品化的ASF疫苗投入市场，还会成为免疫监测的强有力手段。同时免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidasemonolayerassay，IPMA)具有快速、敏感、特异的特点。在光学显微镜下即可观察并判定结果。另外，IPMA反应板可提前制备，4℃长期保存；IPMA的反应结果可长期保存，便于观察和分析。
[0006]我国生猪饲养大致分为散养和规模化养殖两种类型，它们在饲养管理、实验室检测能力和防疫水平上存在差异。对于散养的农户和饲养管理水平较低的中小企业来讲，疫病防控体系往往不健全，检测设备也相对落后或匮乏，因此在非洲猪瘟疫病传播期间，IPMA检测方法是一种不错的选择。
[0007]但是IPMA检测对于抗原的安全性要求，是我国非洲猪瘟病毒流行分离株(PIG/HLJ/18) 所不能满足的，其次针对ASF耐过猪、ASF弱毒株感染猪，抗体反应不明显，这时会影响IPMA 的检出率。国外ASF
‑
IPT(ASF
‑
IPMA)检测方法中采用的病毒是ASF细胞适应株，采
用的细胞为MS或Vero细胞，适应后的毒株突变较多，可能存在未知的抗原性变化。
[0008]因此，构建与遴选出安全有效的非洲猪瘟减毒株是非洲猪瘟IPMA方法建立的基础，同时进一步提高抗原抗体反应结果的呈现度将进一步提高IPMA检测结果的准确性。

技术实现思路

[0009]中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高首席的重要人兽共患与烈性外来病团队通过对我国非洲猪瘟病毒流行分离株(PIG/HLJ/18)进行了部分基因敲除，构建与遴选出安全有效的非洲猪瘟减毒株(HLJ/18
‑
7GD)，为非洲猪瘟IPMA方法的建立奠定了基础。同时遴选出PK15细胞作为非洲猪瘟减毒株(HLJ/18
‑
7GD)的接种细胞，获得了形态均一、着色特异的感染细胞，降低了IPMA的结果误判率。
[0010]在以上科学发现的基础上，完成了本专利技术。
[0011]首先，本专利技术提供一种非洲猪瘟血清抗体IPMA检测试剂，所述检测试剂中非洲猪瘟病毒为非洲猪瘟减毒株(HLJ/18
‑
7GD)(保藏号：CCTCC NO：V201925和CCTCC NO：V201924。)。
[0012]进一步，所述检测试剂中以PK15细胞作为非洲猪瘟减毒株(HLJ/18
‑
7GD)的接种细胞。
[0013]其次，本专利技术提供一种非洲猪瘟血清抗体IPMA检测试剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0014]1、种毒的选择：选择以非洲猪瘟减毒株(HLJ/18
‑
7GD株)作为种毒；
[0015]2、反应板的制备：在细胞板中培养PK15细胞，待细胞密度为80
‑
90％时将培养液弃去，接种HLJ/18
‑
7GD毒株，置于培养箱中培养，制得反应板。
[0016]3、结果的观察：采用1:10—1:50的稀释倍数孵育ASFV高免猪阳性血清，1:1000
‑
1:5000 的比例稀释抗猪二抗并进行孵育，用显色液显色后，于普通光学显微镜下观察显色结果。
[0017]进一步，优选病毒感染剂量为5
×
106TCID
50
/mL
‑2×
107TCID
50
/mL，更优选为 1
×
107TCID
50
/mL。优选病毒复制时间为60h
‑
80h时，更优选为72h。
[0018]进一步，血清稀释倍数为1:80
‑
1:160，更优选血清稀释倍数为1:100。
[0019]进一步，二抗稀释度为1：1000
‑
1：2000倍稀释，更优选1:2000倍稀释。
[0020]本专利技术的非洲猪瘟血清抗体IPMA检测试剂以HLJ/18
‑
7GD病毒为种毒，以PK15细胞为感染细胞，染色后，感染HLJ/18
‑
7GD病毒细胞均着色均匀，形态均一，均为小而规则的深玫瑰红色圆形着色，阴性对照细胞孔背景干净，无非特异性着色。
[0021]检测用抗原是感染细胞的全病毒，所以检测出的抗体能够较真实地体现抗体本身或接近抗体本身的血清反应，因此在非洲猪瘟缺乏针对所有毒株有效中和抗体的条件下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟血清抗体IPMA检测试剂，所述检测试剂中非洲猪瘟病毒选择非洲猪瘟减毒株(HLJ/18
‑
7GD)为种毒。2.如权利要求1所述的非洲猪瘟血清抗体IPMA检测试剂，所述检测试剂中以PK15细胞作为非洲猪瘟减毒株(HLJ/18
‑
7GD)的接种细胞。3.如权利要求1所述的非洲猪瘟血清抗体IPMA检测试剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)、种毒的选择：选择以非洲猪瘟减毒株(HLJ/18
‑
7GD株)作为种毒；(2)、反应板的制备：在细胞板中培养PK15细胞，待细胞密度为80
‑
90％时将培养液弃去，接种HLJ/18
‑
7...

【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，刘文兴，陈伟业，刘任强，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：