提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，所述的方法选自：（1）改变乳酸菌亚群的分布；（2）调控乳酸菌亚群耐酸异质性；（3）诱导bgl操纵子表达；或者，（4）使用诱导物，调控bgl操纵子基因表达。此方法成本低廉、操作简便、成功率高，为工业化生产提供良好的保证，可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品方面，为乳酸菌稳定性提高提供一个具现实意义的方法，从而提高产品品质，延长产品货架寿命。延长产品货架寿命。延长产品货架寿命。

【技术实现步骤摘要】
提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，尤其涉及一种提高乳酸菌耐酸能力的方法。

技术介绍

[0002]益生菌是通过调节肠道微生物从而影响人体健康的最有效和直接的手段。到目前为止，作为最传统、最普遍的益生菌，乳酸菌及双歧杆菌常被用作添加剂及发酵食品，且由于其潜在的益生作用而受到越来越多的研究。我国益生菌产业飞速发展，但自主益生菌菌株活力和功能不稳定，对环境胁迫耐受能力不高。现有技术通过适应性进化筛选具有高耐受能力突变株，或通过基因工程技术提高益生菌对环境胁迫耐受能力。适应性进化方法随机性较大，获得高耐受菌株概率低且操作耗时；而基因工程菌株根据法规要求不得直接应用食品生产，须依据《农业转基因生物安全管理条例》进行严格安全性评价，并通过卫健委新资源食品原料申报审批后才可用于食品加工，但目前在我国尚无先例。
[0003]酸是乳酸菌在加工运输过程中及被人体摄入后面临的重要环境胁迫因子，对菌株的活力和益生功能的发挥有重要影响。酸胁迫是由乳酸菌代谢产物乳酸、乙酸等酸性物质造成的，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的pH通常较胞外的pH高0.5
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1.0，进入胞内的乳酸、乙酸等迅速解离，导致胞内pH的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌食品微生物制造的效率。乳酸菌在酸胁迫下会出现耐酸能力不同的亚群，按照其耐受能力的差异将亚群区分为：完整活细胞亚群、损伤菌亚群、死细胞亚群。乳酸菌亚群耐受能力的异质性决定乳酸菌的耐酸能力，亚群的分布决定菌株的活性。
[0004]乳酸菌常利用β
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葡萄糖苷作为碳源，水杨苷属于β
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葡萄糖苷中的一种，水杨苷能够提高乳酸菌的群体耐酸能力，调控其酸胁迫响应异质性，表现为完整活细胞亚群比例更高，损伤细胞亚群和死细胞亚群比例更低；水杨苷能够通过增加供能、保护细胞膜，从而提高乳酸菌的酸致死存活率；水杨苷的存在促进了碳源的转运利用，影响GntR转录调节因子、Hsp蛋白质伴侣等应激蛋白的表达，从而调控酸胁迫响应异质性。
[0005]bgl操纵子对于β
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葡萄糖苷的转运和水解至关重要，对乳酸菌亚群酸胁迫响应异质性具有调控作用，bgl操纵子包含三个结构基因bglG，bglF和bglB和一个调控区bglR。其中，bglG和bglB结构基因能够调控酸胁迫后完整活细胞亚群、损伤细胞亚群和死细胞亚群的比例，从而调控菌株耐酸能力和决定菌株的活性。
[0006]CN201611247840.3公开了一种GAD基因，所述基因可用于提高乳酸菌耐酸胁迫能力，具体方法是向乳酸菌中引入含有GAD基因的重组质粒，通过在乳酸菌中过量表达合成γ
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氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶以提高乳酸菌耐酸胁迫能力。该方法的缺点是工作量大、效率低。
[0007]CN201810964772.5公开了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用，该专利技术以编码硫胺素转运蛋白ThiT的基因为目的基因，以乳酸菌为表达宿主，构建了一种应用广
泛的乳酸菌工程菌，此乳酸菌工程菌的酸胁迫抗性得到了显著提高。但是，此方法存在成本高、成功率低等问题。
[0008]CN20201126465.2公开了一种提高重组大肠杆菌酸胁迫抗性的方法，以海藻糖6
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磷酸水解酶TreC的基因为目的基因，以大肠杆菌为表达宿主，构建了一类可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的大肠杆菌工程菌。但大肠杆菌本身含有内毒素和可能毒力因子，菌体应用于食品具有一定安全风险，需要进行严格安全评价。
[0009]现有技术虽在一定程度上可提高乳酸菌耐酸胁迫能力，但却同时存在工作量大、效率低或成本高、成功率低、应用限制等问题，菌株存活率依旧不是很高，提高乳酸菌酸胁迫抗性的效果并不十分明显，并且基因工程菌株由于其安全性局限，尚不能完全以活菌形式进行应用，实用性不强。

技术实现思路

[0010]为克服现有技术的不足，本专利技术人通过大量的实验，提供了一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法及采用此方法制备得到的酸胁迫抗性提高的乳酸菌的应用，该方法操作简便、实用性强、工作量少、成功率高、成本低且效果优异、应用范围较为广泛。
[0011]一方面，本专利技术提供了一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法。
[0012]本专利技术提供了一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，所述的方法选自：（1）改变乳酸菌亚群的分布；（2）调控乳酸菌亚群耐酸异质性；（3）诱导bgl操纵子表达；或者，（4）使用诱导物，调控bgl操纵子基因表达。
[0013]进一步地，所述的诱导物选自β
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葡萄糖苷类物质。
[0014]进一步地，所述β
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葡萄糖苷类物质中包括水杨苷。
[0015]进一步地，所述的诱导物为水杨苷。
[0016]进一步地，所述的亚群包括完整活细胞亚群、损伤菌亚群和死细胞亚群，所述的改变乳酸菌亚群的分布为提高完整活细胞亚群的比例，所述的提高完整活细胞亚群的比例是指完整活细胞亚群的比例达到50%以上，优选地，所述的提高完整活细胞亚群的比例是指完整活细胞亚群的比例为50%~80%（如50.4%、52%、54%、56.3%、58%、60%、65%、70%、75%、80%）。
[0017]进一步地，所述的调控乳酸菌亚群耐酸异质性为提高乳酸菌的酸致死存活率和改变不同亚群间的可培养性，所述的提高乳酸菌的酸致死存活率是指乳酸菌的酸致死存活率达15%以上，优选地，所述的提高乳酸菌的酸致死存活率是指乳酸菌的酸致死存活率达17%以上（如17.37%、18%、19%、20%），所述的改变不同亚群间的可培养性是指完整活细胞亚群可培养性最高，完整活细胞亚群可培养性达90%以上，优选地，所述的完整活细胞亚群可培养性达95%以上（如95%、96%、97%、98.15%、99%、100%）。
[0018]进一步地，所述的bgl操纵子包含三个结构基因，分别为bglG，bglF和bglB。
[0019]进一步地，所述的乳酸菌选自乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属中的一种，所述的乳杆菌属包括干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，所述的双歧杆菌属包括动物双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和两岐双歧杆菌，所述的链球菌属包括乳酸链球菌、
乳酪链球菌、丁二酮乳酸链球菌和嗜热乳链球菌。
[0020]进一步地，所述的乳酸菌选自副干酪乳杆菌，所述的副干酪乳杆菌包括副干酪乳杆菌L9。
[0021]另一方面，本专利技术提供了利用上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法制备得到的酸胁迫抗性提高的乳酸菌。
[0022]进一步地，所述的酸胁迫抗性提高的乳酸菌是选自如下方法制备得到的：（1）改变乳酸菌亚群的分布；（2）调控乳酸菌亚群耐酸异质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述的方法选自：（1）改变乳酸菌亚群的分布；（2）调控乳酸菌亚群耐酸异质性；（3）诱导bgl操纵子表达；或者，（4）使用诱导物，调控bgl操纵子基因表达。2.根据权利要求1所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述的诱导物选自β
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葡萄糖苷类物质。3.根据权利要求2所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述β
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葡萄糖苷类物质中包括水杨苷。4.根据权利要求1或2所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述的诱导物为水杨苷。5.根据权利要求1所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述的bgl操纵子包含bglG，bglF和bglB。6.根据权利要求1所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述的乳酸菌选自乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属中的一种，所述的乳杆菌属包括干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵亮，沈志超，梁晶晶，陈龙，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：