一种基于线性质粒载体从基因组文库中靶向克隆目标片段的方法技术

本发明专利技术涉及靶向克隆技术领域，特别涉及一种基于线性质粒载体从基因组文库中靶向克隆目标片段的方法。包括：带有tos的环形质粒通过PCR扩增方式，在体外扩增并使用TelN原端粒酶酶切获得线性化的克隆载体同时，在载体两端引入与目标基因组片段侧翼相同的序列，得到高浓度线性化载体；将线性化载体与基因组文库进行体外组装，得到组装产物；在宿主基因中整合入TelN蛋白表达基因，得到整合有TelN蛋白的宿主；将组装产物转入整合有TelN蛋白的宿主中，筛选目标片段。本发明专利技术技术具有高效、靶向性强、低成本、大容量、易操作等特点。基于该发明专利技术能实现对基因组大片段的高效率一步克隆，实现最大156kb长度基因组序列的克隆。156kb长度基因组序列的克隆。

【技术实现步骤摘要】
Combined with RecET recombination)等靶向克隆技术。CATCH技术主要改进对目标基因序列的获取方式，使用CRISPR/Cas9系统对需求序列进行靶向剪切，得到目标序列，然后体外使用传统的Gibson assembly组装，电转入大肠杆菌宿主中，由抗性培养基和PCR筛选出阳性克隆。但CATCH克隆技术需要专门设计CRISPR系统，步骤繁多，存在脱靶风险以及剪切效率问题，并且一次只能靶向一段序列。
[0007]CAPTURE技术使用CRISPR/Cas12a系统剪切获取目标基因序列，在体外使用T4 DNA聚合酶和外切酶混合组装液进行体外组装，然后电转入大肠杆菌中，在辅助质粒和Cre酶的作用下在细胞内环化，最后在筛选平板上得到正确克隆且环化的质粒。但CAPTURE仍旧需要专门设计CRISPR系统，同时需要辅助质粒，步骤繁多，存在脱靶风险以及剪切效率问题，虽然克隆效率高，但是阳性克隆数目少，存在风险，同时也存在每次只能靶向单一片段问题。
[0008]ExoCET技术利用整合噬菌体RecET基因的大肠杆菌同源重组能力，将末端具有同源序列的目标基因和载体共同电转入大肠杆菌中，通过诱导表达大肠杆菌体内同源重组蛋白，从而实现对目标序列的克隆。ExoCET技术依赖于RecET的同源重组能力，表明该技术对克隆重复序列或者具有与大肠杆菌宿主基因组相同或相似的重复序列具有一定局限性。
[0009]上述克隆方法主要对目标片段的获取或者组装试剂的优化与改进，克隆的序列往往以环形质粒的形式保存在大肠杆菌中，但是环形质粒不适用于重复序列和高AT等复杂序列的保存。环状质粒在大肠杆菌中往往保持扭曲类似于“麻花”形态，从而在复制过程中重复或者回文序列容易发生缺失、异位。据报道，线性质粒对克隆重复序列具有很大的优势，比如线性“pJAZZ”载体可以克隆重复或不稳定的序列，该载体利用TelN
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tos策略在大肠杆菌中整合TelN蛋白，利用TelN蛋白特定识别并剪切tos序列，在大肠杆菌体内维持线性质粒。但是，此载体虽然具有线性载体的稳定性，但不具有靶向克隆特性，而且不能随意更改添加同源序列，同时不易获取高浓度克隆载体。该线性质粒载体克隆能力为30
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40kb，整体来说，目前仅用于建库。从噬菌体N15中分离出的TelN原端粒酶蛋白可以将tos序列切割成两端共价封闭的发夹结构，这种结构可以抵抗外切酶的消化，类似于端粒，保持质粒在大肠杆菌体内以线性的形式稳定遗传。同时，TelN线性质粒在哺乳动物细胞中可稳定携带100kb的DNA序列，并且在DNA疫苗上也有潜在的应用价值。
[0010]为了克服目前靶向克隆方法复杂程度高、不易开展、对复杂基因组序列的克隆依旧困难等难题，需要开发一种简单易行的线性克隆方法。

技术实现思路

[0011]有鉴于此，本专利技术提供了一种基于线性质粒载体从基因组文库中靶向克隆目标片段的方法。该专利技术方法解决了基因大片段靶向克隆步骤繁多、克隆效率低、操作困难、应用性不强的问题，为一种高效率、易操作、应用性强的靶向克隆技术平台。
[0012]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0013]本专利技术提供了一种基于线性质粒载体从基因组文库中靶向克隆目标片段的方法，包括如下步骤：
[0014]在环形质粒上添加tos序列，所得带有tos的环形质粒在进行体外PCR扩增并使用TelN原端粒酶进行线性化的同时，在载体两端引入与目标基因组片段侧翼相同的序列，得到高浓度线性化克隆载体；
[0015]将线性化克隆载体与基因组文库进行体外组装，得到组装产物；
[0016]在宿主基因中整合入TelN蛋白表达基因盒，得到整合有TelN蛋白的宿主；
[0017]将组装产物转入整合有TelN蛋白的宿主中，筛选目标片段。
[0018]本专利技术通过设计构建克隆载体和大肠杆菌宿主，提高靶向序列的克隆效率，开发了一种简单的克隆方法，称为tos
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assisted precise targeting of chromosome segments(TAPE)。将TelN
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tos系统与可变线性质粒载体结合，在体外从基因组文库中直接克隆目标DNA序列。利用TAPE克隆平台直接克隆目的序列，克隆的目标序列最终在大肠杆菌内以线性细菌染色体的形式保存在大肠杆菌宿主中。
[0019]简而言之，TAPE方法可以看作是对传统BAC文库构建的一次改进，使其具有靶向性和稳定性。具体原理为，首先在环形质粒上添加tos序列，通过PCR扩增得到线性载体的同时并在载体两端由引物引入添加40bp左右与目标基因组片段的同源序列，作为“钓取”目标序列的“鱼钩”。使用限制性内切酶对固定在低熔点胶块中的基因组进行酶切，通过溶胶回收得到基因组文库。将载体与基因组文库混合，然后使用组装试剂进行体外组装。组装混合液进一步电转入整合有TelN蛋白的宿主中，在筛选平板上通过PCR进一步筛选。本专利技术使用TAPE平台一步靶向克隆了F9细胞中长度为16kb的线粒体序列、长度为124kb包含着丝粒序列的酵母基因组序列以及156kb细菌基因组目标片段。TAPE平台具有容量大、操作方便、效率高等优点，是快速获取目标基因组序列的实用工具。
[0020]TAPE方法也可以看作“pJAZZ”线性质粒的改革版本，赋予线性质粒克隆靶向性和高容量，同时具备BAC质粒的稳定性，大大降低目标基因组片段获取难度，为研究人员提供一个简单操作克隆平台。并且，可以通过引物在线性质粒载体引入多克隆位点，为未来未知复杂生物基因组的测序提供强有力的文库构建工具。
[0021]在本专利技术中，环形质粒选自但不限于pBAC质粒、pBR322质粒、ColE1质粒、pSC101或其衍生质粒。
[0022]作为优选，tos序列的添加位点为incC元件和sopA元件之间。所述tos序列的添加位点通过实验优化验证为incC元件和sopA元件之间。但不限于此位点。
[0023]作为优选，与目标基因组片段侧翼相同的序列的大小为20～100bp。
[0024]优选地，与目标基因组片段侧翼相同的序列的大小为30～50bp。
[0025]在本专利技术中，宿主选自但不限于大肠杆菌、酵母或哺乳动物。
[0026]在本专利技术中，基因组文库选自但不限于大肠杆菌基因组文库、酿酒酵母基因组文库或者哺乳动物基因组文库。
[0027]作为优选，基因组文库的构建方法为将基因组DNA采用限制性内切酶进行酶切。
[0028]在本专利技术中，限制性内切酶选自但不限于NotI、SbfI、MluI。
[0029]或者，基因组文库的构建方法为：使用CRISPR/cas系统酶切基因组DNA。
[0030]作为优选，组装所用试剂为HiFi DNA Assembly MasterMix、Gibson试剂或其它组装试剂。
[0031]在本专利技术中，在载体两端引入与目标基因组片段侧翼相同的序列的同时，还可包括在线性化载本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于线性质粒载体从基因组文库中靶向克隆目标片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：在环形质粒上添加tos序列，所得带有tos的环形质粒在进行体外PCR扩增并使用TelN原端粒酶进行线性化的同时，在载体两端引入与目标基因组片段侧翼相同的序列，得到高浓度线性化克隆载体；将线性化克隆载体与基因组文库进行体外组装，得到组装产物；在宿主基因中整合入TelN蛋白表达基因盒，得到整合有TelN蛋白的宿主；将组装产物转入整合有TelN蛋白的宿主中，筛选目标片段。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环形质粒选自但不限于pBAC质粒、pBR322质粒、ColE1质粒、pSC101或其衍生质粒。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述tos序列的添加位点为incC元件和sopA元件之间，但不限于此位点。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述与目标基因组片段侧翼相同的序列的大小为...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，崔有志，李炳志，周见庭，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：