一种基于线性质粒载体从基因组文库中靶向克隆目标片段的方法技术

本发明专利技术涉及靶向克隆技术领域，特别涉及一种基于线性质粒载体从基因组文库中靶向克隆目标片段的方法。包括：带有tos的环形质粒通过PCR扩增方式，在体外扩增并使用TelN原端粒酶酶切获得线性化的克隆载体同时，在载体两端引入与目标基因组片段侧翼相同的序列，得到高浓度线性化载体；将线性化载体与基因组文库进行体外组装，得到组装产物；在宿主基因中整合入TelN蛋白表达基因，得到整合有TelN蛋白的宿主；将组装产物转入整合有TelN蛋白的宿主中，筛选目标片段。本发明专利技术技术具有高效、靶向性强、低成本、大容量、易操作等特点。基于该发明专利技术能实现对基因组大片段的高效率一步克隆，实现最大156kb长度基因组序列的克隆。156kb长度基因组序列的克隆。

【技术实现步骤摘要】
Combined with RecET recombination)等靶向克隆技术。CATCH技术主要改进对目标基因序列的获取方式，使用CRISPR/Cas9系统对需求序列进行靶向剪切，得到目标序列，然后体外使用传统的Gibson assembly组装，电转入大肠杆菌宿主中，由抗性培养基和PCR筛选出阳性克隆。但CATCH克隆技术需要专门设计CRISPR系统，步骤繁多，存在脱靶风险以及剪切效率问题，并且一次只能靶向一段序列。
[0007]CAPTURE技术使用CRISPR/Cas12a系统剪切获取目标基因序列，在体外使用T4 DNA聚合酶和外切酶混合组装液进行体外组装，然后电转入大肠杆菌中，在辅助质粒和Cre酶的作用下在细胞内环化，最后在筛选平板上得到正确克隆且环化的质粒。但CAPTURE仍旧需要专门设计CRISPR系统，同时需要辅助质粒，步骤繁多，存在脱靶风险以及剪切效率问题，虽然克隆效率高，但是阳性克隆数目少，存在风险，同时也存在每次只能靶向单一片段问题。
[0008]ExoCET技术利用整合噬菌体RecET基因的大肠杆菌同源重组能力，将末端具有同源序列的目标基因和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于线性质粒载体从基因组文库中靶向克隆目标片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：在环形质粒上添加tos序列，所得带有tos的环形质粒在进行体外PCR扩增并使用TelN原端粒酶进行线性化的同时，在载体两端引入与目标基因组片段侧翼相同的序列，得到高浓度线性化克隆载体；将线性化克隆载体与基因组文库进行体外组装，得到组装产物；在宿主基因中整合入TelN蛋白表达基因盒，得到整合有TelN蛋白的宿主；将组装产物转入整合有TelN蛋白的宿主中，筛选目标片段。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环形质粒选自但不限于pBAC质粒、pBR322质粒、ColE1质粒、pSC101或其衍生质粒。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述tos序列的添加位点为incC元件和sopA元件之间，但不限于此位点。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述与目标基因组片段侧翼相同的序列的大小为...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，崔有志，李炳志，周见庭，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：