间作玉米下花生叶片基因差异表达的比较转录组分析方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及间作玉米下花生叶片基因差异表达的比较转录组分析方法，本发明专利技术利用RNA

【技术实现步骤摘要】
间作玉米下花生叶片基因差异表达的比较转录组分析方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及间作玉米下花生叶片基因差异表达的比较转录组分析方法。

技术介绍

[0002]花生是我国重要油料作物和经济作物，花生间作是目前我国广泛采用的一种在时空上和生态上绿色高效高产的种植模式，且不同农作物之间的间作栽培模式非常丰富。其中，玉米间作花生具有传统单作不可比拟的优势，玉米和花生的生长发育在时空上互补，两者间作不仅可以通过改变农田生态结构，在时空上充分利用光、温、水、热及养分等资源，提高了间作胁迫下玉米对强光及花生对弱光的高效利用能力，促进间作作物对胁迫的应激能力、能量和物质的转化与积累，最终实现作物产量和生物量的增加以及土地总产出率。
[0003]在玉米间作花生的基础理论研究方面，研究表明，间作体系通过影响玉米和花生的根系生长与分布，提高两者对地下资源的充分利用效率，从而实现二者的间作优势，还可能是间作体系促进了豆科作物固定更多的氮，同时释放大量H+来促进根系活化与吸收磷元素，而磷素营养在植物光合作用系统中发挥重要调控作用；此外，玉米根系分泌物能高效活化土壤中难溶性铁以利于花生吸收而改善花生的铁营养；还有研究表明，玉米在强光胁迫下叶片对光能传递和转化的效率并没有明显增强，而间作花生改善玉米叶片适应强光的关键在于增强功能叶对CO2的固定羧化能力。
[0004]相比单作，玉米间作花生优势明显，但该间作体系也会因玉米花生间对地下资源产生竞争性吸收和利用而引发各种胁迫(在此称之为“间作胁迫”)，比如水分、养分和光资源等胁迫。在玉米花生间作体系中，花生对地上地下资源的竞争吸收和利用在整个生育期中一直处于劣势，尤其是对N、P和光照等资源的吸收和利用。虽然株高差异明显的玉米与花生的间作复合群体的产量明显提高，但高秆作物的玉米对矮秆作物的花生会引发时空上的生境胁迫和种间竞争，而由此引起的生境胁迫尤其是弱光胁迫将会严重影响矮秆作物的生长发育，并导致矮秆作物的生产力受到比较严重的影响。
[0005]前人就间作玉米胁迫对花生形态发育、光合特性和生理特性方面的影响研究已有相对较多报道，但对花生应答间作玉米胁迫的深层机理知之甚少，且花生应答间作玉米胁迫以调控其荚果膨大的机理也缺乏研究，更未见利用转录组测序对荚果膨大期花生功能叶应答间作玉米胁迫的关键差异表达基因及代谢通路进行发掘和分析的研究报道。为了深入地分析花生功能叶响应间作玉米胁迫以影响其荚果膨大的转录调控，有必要深入挖掘间作玉米胁迫下花生荚果产量形成的重要基因和关键代谢通路，为利用定向化学调控技术以减少间作玉米胁迫对花生产量造成的不利影响提供理论依据。

技术实现思路

[0006]鉴于上述内容，有必要深入挖掘间作玉米胁迫下花生荚果产量形成的重要基因和关键代谢通路，为利用定向化学调控技术以减少间作玉米胁迫对花生产量造成的不利影响
提供理论依据。
[0007]为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]对间作玉米下花生叶片基因差异表达的比较转录组分析的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.36所示；所述核苷酸序列SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.2为内参基因引物对，所述核苷酸序列SEQ ID NO.3
‑
SEQ ID NO.36为17个重要代谢基因引物对；所述花生叶片选自花生荚果膨大期的功能叶。
[0009]本专利技术还包括所述的引物组在分析玉米和花生间作和/或花生单作的荚果膨大期花生功能叶基因差异表达分析中的应用。
[0010]进一步的，所述花生荚果膨大期为：花生种植后90d
‑
110d；花生种植区为广西全境。
[0011]本专利技术还包括所述对间作玉米下花生叶片基因差异表达的比较转录组分析的引物组的获取方法，所述方法为：
[0012](1)培育花生参试材料：参试材料包括玉米与花生间作的实验组花生功能叶和单独种植花生的对照组花生功能叶；
[0013](2)提取步骤(1)实验组和对照组两组花生功能叶的RNA；构建cDNA文库；
[0014](3)对构建的文库进行测序、质量控制获得高质量的序列信息；
[0015](4)将步骤(3)获得的序列信息与两个二倍体祖先野生种花生的全基因组序列进行比对，获取在参考基因组上的位置信息，获得Mapped reads和非Mapped reads，基于Mapped reads进行后续生物信息学分析；
[0016](5)通过Mapped reads在参考基因组上的位置信息，使用Cufflinks软件的Cuffquant和Cuffnorm组件，采用FPKM法对样品转录本和基因的表达水平进行定量；
[0017](6)基于参考基因组序列，使用Cufflinks软件对Mapped reads进行拼接，寻找未被注释的转录区，发掘新基因；使用BLAST软件将发掘的新基因与NR、Swiss
‑
Prot、GO、COG、KOG、Pfam和KEGG数据库进行序列比对，使用KOBAS2.0得到新基因的KEGG Orthology结果；预测完新基因的氨基酸序列之后使用HMMER软件与Pfam数据库比对，获得新基因的注释信息；
[0018](7)根据比较转录组测序结果，有针对性地挑选与碳氮代谢、氨基酸代谢、脂类代谢、糖代谢和叶绿素代谢及植物激素信号转导和植物与病原菌互作相关的差异表达基因以及核糖磷酸
‑3‑
差向异构酶和甘油
‑3‑
磷酸
‑2‑
O
‑
酰基转移酶这两个代谢重要基因，以Actin11为内参基因，设计得到如权利要求1所述的引物组。
[0019]进一步的，所述玉米与花生间作的实验组其所用玉米品种为桂单0810；其所用花生品种为桂花836。
[0020]本专利技术还包括所述对间作玉米下花生叶片基因差异表达进行分析的方法，所述方法为：提取花生功能叶的RNA，合成cDNA第一链，稀释20倍后的cDNA第一链作为qRT
‑
PCR的扩增模板，使用2
‑
ΔΔCt
法计算样品差异基因的相对表达量；
[0021]所述qRT
‑
PCR反应中，核苷酸序列SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.2为内参基因Actin 11的引物对；
[0022]核苷酸序列SEQ ID NO.3
‑
SEQ ID NO.36为17个重要代谢基因引物对。
[0023]上述17个重要代谢基因引物对的对应关系如下：
[0024]其中，核苷酸序列SEQ ID NO.3
‑
SEQ ID NO.4为Araip.816XH基因的引物对；
[0025]其中，核苷酸序列SEQ ID NO.5
‑
SEQ ID NO.6为Arai本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.间作玉米下花生叶片基因差异表达的比较转录组分析的所用引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.36所示；所述核苷酸序列SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.2为内参基因引物对，所述核苷酸序列SEQ ID NO.3
‑
SEQ ID NO.36为17个重要代谢基因引物对；所述花生叶片选自花生荚果膨大期的功能叶。2.如权利要求1所述的引物组在分析玉米花生间作和/或花生单作的荚果膨大期花生功能叶基因差异表达分析中的应用。3.如权利要求1所述对间作玉米下花生叶片基因差异表达的比较转录组分析的引物组的获取方法，其特征在于，所述方法为：(1)培育花生参试材料：参试材料包括玉米与花生间作的实验组花生功能叶和单独种植花生的对照组花生功能叶；(2)提取步骤(1)实验组和对照组两组花生功能叶的RNA；构建cDNA文库；(3)对构建的文库进行测序、质量控制获得高质量的序列信息；(4)将步骤(3)获得的序列信息与两个二倍体祖先野生种花生的全基因组序列进行比对，获取在参考基因组的位置信息，获得Mapped reads和非Mapped reads，基于Mapped reads进行后续生物信息学分析；(5)通过Mapped reads在参考基因组上的位置信息，使用Cufflinks软件的Cuffquant和Cuffnorm组件，采用FPKM法对样品转录本和基因的表达水平进行定量；(6)基于参考基因组序列，使用Cufflinks软件对Mapped reads进行拼接，寻找未被注释的转录区，发掘新基因；使用BLAST软件将发掘的新基因与NR、Swiss
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊发前，刘俊仙，刘菁，唐荣华，邹成林，李忠，韩柱强，唐秀梅，丘立杭，吴海宁，黄志鹏，贺梁琼，蒋菁，钟瑞春，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：