铁蛋白包载药物及其制备方法技术

本公开涉及一种铁蛋白包载药物及其制备方法。所述铁蛋白包载药物由铁蛋白包载药物反应体系孵育制成，其中所述铁蛋白包载药物反应体系包括：药物、铁蛋白和缓冲液，其中，所述缓冲液为Tris

【技术实现步骤摘要】
铁蛋白包载药物及其制备方法


[0001]本公开涉及生物医药领域，特别涉及一种纳米载药系统包载药物及其制备方法。

技术介绍

[0002]铁蛋白是一类广泛存在于动物、植物及微生物中的天然铁贮存蛋白。铁蛋白分子量500KD，外壳由24个亚基自组装形成蛋白质外壳，不同脏器组织中的铁蛋白由不同比例H亚基和L亚基构成，每两个亚基反向平行形成一组，构成一个近似正八面体，成4
‑3‑
2重轴对称中空的球状分子，每个铁蛋白分子形成12个二重轴通道、8个三重轴通道和6个四重轴通道。内包铁内核。蛋白外壳外径12nm，内径8nm，铁内核的主要成分为水铁矿(5Fe2O3·
9H2O)。
[0003]由于铁蛋白自身独特的球形空壳结构、小尺寸和可逆自组装特性，且铁蛋白的H亚基具备与转铁蛋白受体(Tfr
‑
1)结合的主动靶向能力，因此现有技术中通过基因重组方法制备重组铁蛋白用于作为多种药物的载体。其中，将药物包载于重组铁蛋白内腔中是铁蛋白作为纳米药物载体的一种重要方式。
[0004]相较于其它蛋白，铁蛋白非常稳定，pH3.4
‑
10范围内笼状结构稳定，且可耐高温(70℃)，耐受多种变性剂(细菌生产人铁蛋白的新功能及应用，范克龙等，微生物学通报，Mar.20，2014，41(3)：520
‑
538)。因此，目前文献报道的铁蛋白包载药物方式多是利用强变性剂(高浓度脲、盐酸胍)或在极端pH条件下(pH为2.0左右)将铁蛋白亚基解聚，而后再恢复温和生理条件使得解聚的亚基重组装成笼状蛋白，以达到包载药物的目的(CN111150063A)。
[0005]上述的包载药物方法条件变化剧烈，加入变性剂或者从极端酸性/碱性到中性阶段的pH变化可能会影响药物分子的理化性质、改变其结构，从而影响其生物活性，不适用于那些对极端环境不耐受的药物类型，从而限制了包载药物的种类。与此同时，依赖于解聚和重组装的极端包载条件也可能造成部分铁蛋白不能够完成重组装，从而产生变性蛋白杂质；或因重组装不完全导致蛋白笼缺损，药物无法有效包载，使得载药量低，杂质难以控制，产物不均一且不稳定，影响药物的安全性和有效性。
[0006]因此，需要寻求一种新的铁蛋白包载方法，其能够以温和的方式实现药物包载，提高包载效率，减少包载后的杂质和缺损蛋白，以达到成药应用的目的。

技术实现思路

[0007]本公开要解决的技术问题是为了克服现有铁蛋白包载方法存在的包载方法剧烈、包载后缺损蛋白多、包载后药物活性改变等问题。
[0008]本专利技术人为解决上述技术问题，采用一种生理条件下的包药方法，将以铁蛋白为代表的笼状蛋白与待包载药物孵育于包含特定组分的包载溶液中，孵育一段时间，此时，药物进入笼状蛋白内腔，从而实现铁蛋白包载药物。
[0009]该包载方式与现有技术中笼状蛋白使用的变性
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复性方式、笼状蛋白亚基解聚
‑
重聚合方式、以及让药物分子在溶液中自由扩散方式全然不同，其不涉及笼状蛋白亚基的解
聚或破坏笼状蛋白的天然结构，而是以一种温和的方式进行包载。且对影响包药的多个因素进行了反复的多次优化，包括尝试不同的添加剂和辅料，以及比较优化包载温度、原料配比、缓冲体系等各种参数具体条件，经过大量的比较实验，确定了优化的包载条件，通过本公开的包载方式获得的铁蛋白纳米药物与其他包载方式相比，包载量大幅度提高，药物单体比例更高，更稳定。
[0010]具体来说，本公开提出了如下技术方案：
[0011]在一方面，本公开提供了一种铁蛋白包载药物反应体系，其包括：药物、铁蛋白和缓冲液，其中，所述缓冲液为Tris
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HCl缓冲液。
[0012]在一方面，本公开提供了由所述铁蛋白包载药物反应体系孵育制成的铁蛋白包载药物。
[0013]在一方面，本公开提供了一种制备所述铁蛋白包载药物的方法。
[0014]本公开的有益效果包括：
[0015](1)本公开的包药方法为生理条件，不会导致笼状蛋白变性，颗粒均一，不会引起笼状蛋白缺损；
[0016](2)本公开的包药方法经过多次优化，包载量大，纯度高。
[0017](3)本公开包载获得的药物均一性好，稳定性强。
附图说明
[0018]图1为HFn
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DOX弱酸工艺包载后DOX纯度UPLC
‑
RP检测结果。
[0019]图2为表6中样品5包载后DOX纯度UPLC
‑
RP检测结果。
[0020]图3为pH 8.0 20min样品包载后DOX纯度UPLC
‑
RP检测结果。
[0021]图4为Glu为辅料时HFn
‑
DOX的UPLC
‑
RP图谱。
[0022]图5为非Glu为辅料时HFn
‑
DOX的UPLC
‑
RP图谱。
[0023]图6示出了铁蛋白包载药物的抗肿瘤活性。
具体实施方式
[0024]在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
[0025]术语“铁蛋白包载药物反应体系”是指在缓冲液中，通过孵育使铁蛋白包载药物的体系，所述体系包含铁蛋白、药物和缓冲液。在本公开的一个实施方案中，所述药物为多柔比星(DOX)。
[0026]术语“铁蛋白”是指由蛋白外壳和铁内核两部分构成的储铁结构。天然情况下，铁蛋白的蛋白外壳是通常由24个亚基自组装形成的笼状蛋白结构(外径约12nm，内径约8nm)，而铁内核的主要成分为水铁矿。不含铁内核的铁蛋白的蛋白外壳也称为“去铁蛋白”。本文所述“铁蛋白”包括真核生物铁蛋白和原核生物铁蛋白，优选真核生物铁蛋白，更优选哺乳动物铁蛋白，例如人铁蛋白。真核生物铁蛋白通常包括重链铁蛋白单体亚基(H，21kDa)和轻链铁蛋白单体亚基(L，19kDa)。H亚基负责Fe(II)氧化成Fe(III)并包括催化性铁氧化酶位
点，而L亚基在铁成核中发挥作用。H和L亚基共同组装成24聚体的杂聚体铁蛋白。在机体不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有H和L亚基的比例有所不同。然而，通过重组方式，也可以获得仅由H亚基组装成的“重链铁蛋白”或“H铁蛋白”(下文缩写为“HFn”)或仅由L亚基组装成的“轻链铁蛋白”或“L铁蛋白”(下文缩写为“LFn”)。
[0027]此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能包含N端由起始密码子编码的甲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种铁蛋白包载药物反应体系，其包括：药物、铁蛋白和缓冲液，其中，所述缓冲液为Tris
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HCl缓冲液。2.权利要求1所述的铁蛋白包载药物反应体系，其中，所述铁蛋白包载药物反应体系还包含辅料，优选地，所述辅料选自葡萄糖、蔗糖、甘油、海藻糖或山梨醇；优选地，所述辅料选自蔗糖、甘油、海藻糖或山梨醇；更优选地，所述辅料为蔗糖。3.权利要求1或2所述的铁蛋白包载药物反应体系，其中，所述铁蛋白包载药物反应体系还包含添加剂，优选地，所述添加剂选自氯化铵、甲醇、乙醇、丝氨酸、酪氨酸和苯甲酸中的一种或多种；优选地，所述添加剂选自氯化铵、甲醇、乙醇、丝氨酸和苯甲酸中的一种或多种；任选地，所述铁蛋白包载药物反应体系还包含还原剂；优选地，所述还原剂选自硫代硫酸钠、DTT、三(2
‑
羧乙基)膦(TCEP)和硼氢化钠。4.权利要求1
‑
3任一项所述的铁蛋白包载药物反应体系，其中，所述铁蛋白是野生型铁蛋白或突变型铁蛋白；优选地，所述铁蛋白由铁蛋白单体亚基组装而成；优选地，所述铁蛋白单体亚基选自重链铁蛋白单体亚基和/或轻链铁蛋白单体亚基；优选地，所述铁蛋白单体亚基是来源于哺乳动物来源的铁蛋白、两栖类动物来源的铁蛋白、细菌来源的铁蛋白或植物来源的铁蛋白中的任意一种或至少两种组合的铁蛋白单体亚基，优选为哺乳动物来源或细菌来源的铁蛋白单体亚基；优选地，所述哺乳动物来源的铁蛋白包括人源性铁蛋白、鼠源性铁蛋白或马脾脏铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述细菌来源的铁蛋白包括幽门螺杆菌铁蛋白、大肠杆菌铁蛋白或激烈火球菌铁蛋白；优选地，所述铁蛋白的来源包括天然提取产物、人工合成产物或基因工程技术产物中的任一种或至少两种的组合；优选地，所述药物为多柔比星(DOX)；优选地，所述药物与铁蛋白的浓度比为1∶20
‑
1∶50，优选1∶5
‑
1∶10，更优选1∶6
‑
1∶8；优选地，所述药物浓度为0.4
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1.2mg/ml，更优选0.6
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1.0mg/ml；优选地，所述铁蛋白浓度为2
‑
10mg/ml，优选4
‑
8mg/ml，更优选5.5
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8mg/ml；优选地，所述Tris
‑
HCl缓冲液浓度为5
‑
100mM，更优选10
‑
50mM，更优选15
‑
25mM；优选地，所述Tris
‑
HCl缓冲液的pH值大于7.0，优选7.1
‑
9.5、7.2
‑
9.0、7.3
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8.5或7.5—8.0之间；优选地，所述辅料浓度为2％
‑
30％(w/w)，优选3％
‑
10％(w/w)，更优选3
‑
6...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁会，姚德惠，柯天一，张西东，檀琳，劳芳，李彦良，
申请(专利权)人：昆山新蕴达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：