PVA膜固定化酶及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种PVA膜固定化酶及其制备方法。该PVA膜固定化酶包括PVA多孔膜和包埋在PVA多孔膜上的酶，PVA多孔膜为三维结构化PVA多孔膜，酶选自转氨酶、D

【技术实现步骤摘要】
PVA膜固定化酶及其制备方法
[0001]本申请是基于申请日为2020年7月16日、申请号为202010683476.5、专利技术创造名称为
ꢀ“
PVA膜固定化酶及其制备方法”的专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及酶固定化
，具体而言，涉及一种PVA膜固定化酶及其制备方法。

技术介绍

[0003]生物催化正在成为化学品、中间体、精细化学品和最终药物分子制造计划的组成部分。 然而，随着工艺需求的不断扩大，酶应用的效率和经济性变得不可避免。因此，这不仅需要 增强酶活性、特异性和生产力，还需要提高保质期和可回收性，特别是为了促进商业规模应 用的经济可行性。
[0004]酶固定平台为生产过程中适宜地整合酶提供了一种优秀的工具。多年来，已经评估了几 种天然和合成载体对的酶固定效率，比如每个平台都根据其应用、经济和优势进行了专门评 估。固定化生物催化剂在有机合成、污染控制和以诊断为目的等领域具有广泛的应用(EnzymeMicrob Technol，31,171
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8；J Pharm Sci，89,979
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90)。
[0005]通过将酶固定到固体载体上或固体载体内来实现固定化，由此获得非均相固定化酶系统。 酶可以通过多种方法固定，包括物理方式(载体和酶之间存在微弱的相互作用)以及化学方 式(载体与酶形成共价键)(Analyst，133,697
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701；Chem Soc Rev，40,2567
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92；柏林海德堡： Springer，95
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126。)或两者的组合，从而包含各种功能活性的载体。
[0006]酶的物理固定方法包括在膜或膜反应器内、在水不溶性基质上的吸附(物理，离子)比 如在中孔材料上吸附、包含(或凝胶包埋)、用固体膜微囊化、用液膜微囊化、酶促 Langmuir
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Blodgett膜的形成(Anal Chem，1994；66,1120A
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7A)等。在膜包埋或包封的情况下， 所得的酶催化剂取决于膜支持物的性质，例如亲水性、疏水性、反应性官能团密度、孔隙率、 孔径分布、膜厚度、反应器配置等。固定化的固定方法基于酶在膜内的定位，其目的是除了 在操作条件下高度稳定之外还实现酶的更高表达。
[0007]目前，采用多孔膜固定化酶的研究有很多，但是，由于不同酶的结构和活性位点的不同， 导致其固定化方法也有不同，比如在采用PVA膜(聚乙烯醇膜)固定脂肪酶时需要采用戊二 醛进行交联，才能达到利用固定化改善脂肪酶稳定性和活性的目的。另外，在利用多孔膜固 定化木聚糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶、β
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半乳糖苷酶和抗坏血酸氧化酶等酶类时，通常也利 用氨基、羧基、巯基、羟基、咪唑或酚基等基团将多孔膜和酶通过共价键进行结合。由此可 见，现有技术中采用交联剂固定化酶时需要采用高纯度酶，导致固定化方法复杂、酶的负载 量受限。

技术实现思路

[0008]本专利技术的主要目的在于提供一种PVA膜固定化酶及其制备方法，以解决现有技术
胺，或者转氨酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与 发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
[0014]进一步地，上述来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶具有SEQ ID NO.3所 示的氨基酸序列，酮还原酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列发生 突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第94位、第144位和第156 位，且第94位的丙氨酸突变为天冬酰胺，第144位的谷氨酸突变为丝氨酸，第156位的天冬 酰胺突变为苏氨酸或缬氨酸，或者酮还原酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基 酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
[0015]进一步地，上述来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶具有SEQ ID NO.4所示的 氨基酸序列，上述环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序 列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第280位、第435位、 第436位、第438位、第441位、第508位和第510位，且第280位的苯丙氨酸突变为酪氨 酸，第435位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第436位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，第438位的 亮氨酸突变为丙氨酸，第441位的丝氨酸突变为缬氨酸，第510位的亮氨酸突变为缬氨酸， 或者环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点， 且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
[0016]进一步地，上述来源于Rhodococcus ruber
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SD1的环己酮单加氧酶具有SEQ ID NO.5所示 的氨基酸序列，环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列 发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第45位、第190位、第 249位、第257位、第393位、第504位和第559位，且第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸， 第190位的脯氨酸突变为亮氨酸，第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第257位的半胱氨酸 突变为丙氨酸，第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第504位的脯氨酸突变为缬氨酸，第559 位的酪氨酸突变为甲硫氨酸，或者环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到 的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸 序列。
[0017]进一步地，上述PVA膜固定化酶还包括每种酶的辅酶和辅因子，辅酶和辅因子包埋在PVA 多孔膜上。
[0018]进一步地，上述PVA多孔膜上还具有聚乙二醇和/或聚乙烯亚胺，聚乙二醇的分子量为 PEG400～PEG 6000，聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～70KDa。
[0019]进一步地，上述聚乙二醇与PVA多孔膜的质量比为5:4～75:4，聚乙烯亚胺与PVA多孔膜 的质量比为1:12～1:240。
[0020]进一步地，上述酶为粗酶。
[0021]进一步地，上述酶的负载量为0.05～0.4g游离酶/cm2膜或0.03～0.06g干燥的交联酶聚集 体/cm2膜。
[0022]根据本专利技术的又一方面，提供了一种上述任一种的PVA膜固定化酶的制备方法，制备方 法包括：步骤S1，将包含酶与PVA溶液的原料混合预定时间，得到混合体系；步骤S2，将 混合体系加入到模具中并对混合体系进行干燥处理，得到膜包埋的酶，模具为三维结构化模 具以形成三维结构化PVA多孔膜；以及步骤S3，利用磷酸缓冲液对膜包埋的酶进行浸泡
处理 和洗涤后，得到PVA膜固定化酶。
[0023]进一步地，上述混合体系的pH值为6.0～6.5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PVA膜固定化酶，其特征在于，所述PVA膜固定化酶包括PVA多孔膜和包埋在所述PVA多孔膜上的酶，所述PVA多孔膜为三维结构化PVA多孔膜，所述酶选自转氨酶、D
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乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、醇脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖1
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脱氢酶及它们的突变体中的任意一种，所述三维结构化PVA多孔膜具有突起或凹槽形成的三维结构，所述PVA多孔膜上还具有聚乙二醇和/或聚乙烯亚胺，所述聚乙二醇的分子量为PEG400～PEG 6000，所述聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～70KDa。2.根据权利要求1所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述酶为游离酶或交联酶聚集体。3.根据权利要求1或2所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述转氨酶为来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶或者来源于Arthrobacter citreus的转氨酶，或来源于B.thuringiensis的转氨酶，所述酮还原酶为来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶，或者来源于Candida macedoniensis AKU4588的酮还原酶；所述环己酮单加氧酶为来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶，或者来源于Rhodococcus ruber
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SD1的环己酮单加氧酶；所述氨裂解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的氨裂解酶和来源于Solenostemon scutellarioides的氨裂解酶；所述烯还原酶为来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶和来源于Chryseobacterium sp.CA49的烯还原酶；所述亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp的亚胺还原酶和Bacillus cereus的亚胺还原酶；所述氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶和来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；所述腈水解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的腈水解酶和来源于Neurospora crassa OR74A的腈水解酶。4.根据权利要求3所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以下突变位点之一：第7位、第47位、第90位、第95位、第297位、第304位、第380位、第405位和第416位，且第7位的苏氨酸突变为半胱氨酸，第47位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第90位的赖氨酸突变为甘氨酸，第95位的丙氨酸突变为脯氨酸，第297位的异亮氨酸突变为亮氨酸，第304位的赖氨酸突变为天冬氨酸，第380位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第405位的精氨酸突变为谷氨酸，第416位的精氨酸突变为苏氨酸。5.根据权利要求3所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述来源于Arthrobacter citreus的转氨酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：凯莱英生命科学技术天津有限公司，
类型：发明
国别省市：