一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(R)-香茅醛的方法技术

本发明专利技术提供一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(R)

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(R)
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香茅醛的方法


[0001]本专利技术涉及酶工程和手性医药中间体制备
，更具体地涉及一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(R)
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香茅醛的方法。

技术介绍

[0002]光学纯(R)
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香茅醛是一种重要的香料及医药中间体，其可用于饮料、食品、香水等的调香，还可作为合成L
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薄荷醇的原料。工业上主要由天然精油分离获得，也可由柠檬醛经金属催化剂催化加氢制得。
[0003]目前工业上催化柠檬醛生产(R)
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香茅醛主要是通过金属催化剂催化柠檬醛加氢，相关利用生物催化法制备(R)
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香茅醛存在底物浓度低、醛过度还原等问题。2010年，Stewart等人在大肠杆菌中表达Pichia stipitis的烯键还原酶，利用纯化后的烯键还原酶与葡萄糖脱氢酶进行催化反应，在反应5.75h后催化150mM E
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柠檬醛的转化率达到95％(Chemical Communications,2010,46(45):8558
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8560.)；该研究使用的是纯酶作为催化剂，并没有使用全细胞催化系统，且底物E
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柠檬醛需由E/Z
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柠檬醛分离获得，虽然产物(R)
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香茅醛的光学纯度达到98％。但产量还是偏低。2016年，中国专利申请CN106086089A公开了利用氨基酸催化的柠檬醛顺反异构反应，通过在催化柠檬醛的反应中偶联此反应生产(R)
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香茅醛。该专利技术可以以柠檬醛为底物生产(R)
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香茅醛，但产物ee值还是偏低，仅为65.4％。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(R)
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香茅醛的方法，从而解决现有技术中(R)
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香茅醛的制备存在底物浓度低、醛过度还原、产物ee值偏低的问题。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]根据本专利技术的第一方面，提供一种可用于催化生产(R)
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香茅醛的大肠杆菌基因工程菌，所述大肠杆菌基因工程菌是以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为出发菌株，对其基因组上的醇脱氢酶基因adhE进行敲除，同时还通过质粒pET28a整合来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶GDH，以及通过质粒pET21a整合来源于假丝酵母的烯键还原酶HP3，获得一种可用于催化生产(R)
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香茅醛的大肠杆菌基因工程菌，其中，所述醇脱氢酶基因adhE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖脱氢酶GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述烯键还原酶HP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]本专利技术所述的可用于催化生产(R)
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香茅醛的大肠杆菌基因工程菌，是通过Crispr
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Cas9介导的基因敲除方法实现大肠杆菌醇脱氢酶基因的缺失，从而得到醇脱氢酶缺失的大肠杆菌，并在所得的菌株中表达烯键还原酶及葡萄糖脱氢酶基因得到。
[0008]其中，葡萄糖脱氢酶GDH来源于枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis168，参见“枯草芽孢杆菌168产生的一种新磷脂类抗生素bacilysocin[J]；国外医药，抗生素分册；
2002年04期)，烯键还原酶HP3来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis，ATCC 20615)。
[0009]根据本专利技术的第二方面，提供一种如上所述的可用于催化生产(R)
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香茅醛的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：S1：以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为出发菌株，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，实现其基因组上的醇脱氢酶基因adhE的敲除，获得大肠杆菌BL21(DE3)ΔadhE；S2：以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，PCR获得葡萄糖脱氢酶GDH基因片段，使用限制性内切酶双酶切葡萄糖脱氢酶GDH基因的DNA片段和pET28a质粒，连接，获得葡萄糖脱氢酶GDH表达载体；S3：以热带假丝酵母ATCC 20615基因组DNA为模板，PCR获得烯键还原酶HP3基因片段，使用限制性内切酶双酶切烯键还原酶HP3基因的DNA片段和pET21a质粒，连接，获得烯键还原酶HP3表达载体；S4：将步骤S2获得的葡萄糖脱氢酶GDH表达载体及步骤S3获得的烯键还原酶HP3表达载体共同转入步骤S1获得的敲除adhE基因的大肠杆菌BL21(DE3)ΔadhE，得到大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)ΔadhE/pET21a
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HP3/pET28a
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GDH。
[0010]根据本专利技术的一个优选方案，步骤S1包括：S11：以携带有醇脱氢酶adhE的大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，并设计醇脱氢酶编码基因adhE上下游同源臂的引物，进行PCR，得到adhE线性同源重组片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，胶回收纯化；S12：选择醇脱氢酶编码基因adhE上一段长度为20bp的序列设计SgRNA
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adhE的引物，以SgRNA表达质粒为模板，进行聚合酶链式反应，得到SgRNA
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adhE线性化质粒片段，胶回收纯化线性化质粒片段，经DNA连接酶连接后得到连接反应产物，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，通过平板筛选得到重组质粒SgRNA
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adhE；S13：将表达Cas9蛋白的载体质粒pCas9转入原始菌中，筛选出带有pCas9质粒的重组菌，培养重组菌，经L
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阿拉伯糖诱导后制备成电转感受态细胞；S14：将步骤S11得到的所述adhE线性同源重组片段及步骤S12得到的所述重组质粒SgRNA
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adhE一起电转化进入步骤S13中的电转感受态细胞中，进行基因编辑，得到突变的大肠杆菌；S15：去除步骤S14得到的突变的大肠杆菌中的载体质粒，得到大肠杆菌BL21(DE3)ΔadhE。
[0011]优选地，步骤S11中使用的引物adhE
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Up
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F、adhE
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Up
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R、adhE
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Up
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Down
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F和adhE
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Down
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R的序列如SEQ ID NO.5～8所示。
[0012]优选地，步骤S12中使用的引物Sg
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F和adhE
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Sg
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R的序列如SEQ ID NO.9～10所示。
[0013]优选地，步骤S3中使用的引物GDH
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可用于催化生产(R)
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香茅醛的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌是以大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为出发菌株，对其基因组上的醇脱氢酶基因adhE进行敲除，同时还通过质粒pET28a整合来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶GDH，以及通过质粒pET21a整合来源于假丝酵母的烯键还原酶HP3，获得一种可用于催化生产(R)
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香茅醛的大肠杆菌基因工程菌，其中，所述醇脱氢酶基因adhE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖脱氢酶GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述烯键还原酶HP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.一种如权利要求1所述的可用于催化生产(R)
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香茅醛的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为出发菌株，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，实现其基因组上的醇脱氢酶基因adhE的敲除，获得大肠杆菌BL21(DE3)ΔadhE；S2：以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，PCR获得葡萄糖脱氢酶GDH基因片段，使用限制性内切酶双酶切葡萄糖脱氢酶GDH基因的DNA片段和pET28a质粒，连接，获得葡萄糖脱氢酶GDH表达载体；S3：以热带假丝酵母ATCC 20615基因组DNA为模板，PCR获得烯键还原酶HP3基因片段，使用限制性内切酶双酶切烯键还原酶HP3基因的DNA片段和pET21a质粒，连接，获得烯键还原酶HP3表达载体；S4：将步骤S2获得的葡萄糖脱氢酶GDH表达载体及步骤S3获得的烯键还原酶HP3表达载体共同转入步骤S1获得的敲除adhE基因的大肠杆菌BL21(DE3)ΔadhE，得到大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)ΔadhE/pET21a
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HP3/pET28a
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GDH。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S1包括：S11：以携带有醇脱氢酶adhE的大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，并设计醇脱氢酶编码基因adhE上下游同源臂的引物，进行聚合酶链式反应，得到adhE线性同源重组片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，胶回收纯化；S12：选择醇脱氢酶编码基因adhE上一段长度为20bp的序列设计SgRNA
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adhE的引物，以SgRNA表达质粒为模板，进行PCR，得到SgRNA
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adhE线性化质粒片段，胶回收纯化线性化质粒片段，经DNA连接酶连接后得到连接反应产物，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，通过平板筛选得到重组质粒SgRNA

【专利技术属性】
技术研发人员：林金萍，魏东芝，张宝琪，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：