用于实现LP基因启动子区甲基化程度检测的特异性引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于实现LP基因启动子PCR扩增的特异性引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，所述下游引物的核苷酸序列为：SEQID NO.2；特异性引物实现LP基因启动子PCR扩增后，检测LP基因启动子在第65bp与105bp处的CpG2、6位点的甲基化程度。本发明专利技术可以为设计预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长的药物、试剂和方法提供参考，从而为完善精神分裂症诊疗方案提供技术支持，并使得以LP基因启动子区甲基化作为靶点的药物有望成为干预精神分裂症患者入睡潜伏期延长的一种新手段。潜伏期延长的一种新手段。

【技术实现步骤摘要】
用于实现LP基因启动子区甲基化程度检测的特异性引物及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，特别是指一种用于实现LP基因启动子在第65bp与105bp处的CpG2、6位点的甲基化程度检测的特异性引物在制备预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长的药物中的应用。

技术介绍

[0002]精神分裂症(SCZ)是最常见的精神障碍，而睡眠障碍是精神分裂症的重要诊断标准之一，也是精神疾病发生的预测信号。睡眠障碍是难治性精神分裂症复发的危险因素，与患者的低生命质量、社会功能缺陷、心血管疾病和高自杀率相关，其发生率为72.4％。
[0003]失眠是精神分裂症常见睡眠障碍，包括入睡潜伏期(SOL)延长、夜间觉醒增多、多梦、睡眠感缺乏与早醒等，其中入睡潜伏期延长是精神分裂症特异性的睡眠障碍。多导睡眠图是目前临床上检测各种睡眠障碍的标准方法，包括失眠和入睡潜伏期延长，但临床上尚缺乏预测精神分裂症患者出现入睡潜伏期延长的方法。因此，建立预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长的技术方法，对精神分裂症的诊疗有重大意义。
[0004]瘦素(Leptin，简称LP)是一种由脂肪组织分泌的激素，它在血清中的含量与动物脂肪组织大小成正比。瘦素作用于位于中枢神经系统的受体(Leptin Receptor)，从而调控生物的行为以及新陈代谢。
[0005]目前，对LP的相关研究已广泛存在，并关联到多个方面，例如，文献《In Vivo MethylationPatterns of the Leptin Promoter in Human and Mouse》(2006年)指出：LP基因启动子的甲基化通常被强加在合子发育后，这种表现基因型标记可能在调节一种重要的代谢基因的表达上有作用。文献《瘦素基因启动子区
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2548G/A多态性与非酒精性脂肪肝的相关分析》(2006 年)指出：血清瘦素水平可作为评价肝功能的临床指标之一，瘦素基因
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2548G/A等位基因变异情况可应用于对非酒精性脂肪肝病的预测性分析中。文献《瘦素基因甲基化水平与妊娠期糖尿病的相关性》(2017年)指出：瘦素基因启动子区甲基化动态变化过程与妊娠期糖尿病的发病有一定相关性。文献《饮食诱导肥胖小鼠瘦素及瘦素受体基因启动子甲基化探讨》(2010 年)指出：瘦素基因及瘦素受体基因启动子区CpG位点甲基化可能与饮食诱导肥胖小鼠瘦素抵抗无关。文献《瘦素启动子甲基化在骨关节炎发病中的作用》(2011年)指出：瘦素启动子区域部分位点的去甲基化可能是骨关节炎(OA)发生的始动因素之一，为研究OA的致病机制及治疗提供了新的研究方向。
[0006]DNA甲基化的检测通常采用甲基化DNA免疫共沉淀测序技术、甲基化芯片技术、全基因组甲基化测序技术、焦磷酸测序法或质谱法等手段实现，并且在检测过程中，需要对DNA 进行PCR扩增。PCR扩增引物多种多样，而对于LP基因启动子的PCR扩增来说，不同的启动子区域、扩增区域和转录起始位点选择会影响引物的设计、引物扩增性能、扩增结果以及检测目的，例如，文献《瘦素基因启动子区
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2548G/A多态性与非酒精性脂肪肝的相关分析》中采用的PCR扩增引物，上游引物为5'
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AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA
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3'，下游引物为 5'
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TTTGCTGTAATTTTCCCGTGAG
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3'；文献《瘦素基因甲基化水平与妊娠期糖尿病的相关性》中采用的PCR扩增引物，正向引物为5
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TGCGGATTCTTGTGGCTTTGG
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3'，反向引物为 5'
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GACTGACTGCGTGTGTGAAATGT
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3'，β
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actin正向引物为 5
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TGAAGATCAAGATCATTGCTC
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CTC
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3'，β
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actin反向引物为 5
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AACTAAGTCATAGTCCGC
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CTAGAAG
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3'。文献《瘦素启动子甲基化在骨关节炎发病中的作用》中采用的PCR扩增引物，上游引物为5'
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CCAAAACCCTCATCAAGACAATT
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3'，下游引物为5'
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ACCGCTGACTTTCTGTTTGGA
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3'，GAPDH上游引物为 5'
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ATGGGGAAGGTGAAGGTCG
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3'，GAPDH下游引物为 5'
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TAAAAGCAGCCCTGGTGACCG
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3'。
[0007]而在精神分裂症方面，Atmaca等的研究发现，精神分裂症患者血清LP水平比正常对照组明显降低(Serum Leptin and Cholesterol Values in Suicide Attempters，2002年)。Kraus比较了更年期抑郁症、精神分裂症患者、健康对照组BMI及血清LP水平，研究表明各组间BMI 无明显差异，但两患者组血浆LP水平显著低于对照组，而精神分裂症患者血浆LP水平又显著低于更年期抑郁患者(Body Weight,the Tumor Necrosis Factor System,and Leptin Productionduring Treatment with Mirtazapine or Venlafaxine，2002年)。这说明，LP与精神分裂症本身发生也有关，可以认为LP在精神分裂症的病理机制中起重要作用。但Jow等却研究发现与健康对照组比较，重症抑郁症患者血浆瘦素明显降低，而精神分裂症患者血浆瘦素水平却明显升高(Leptin and cholesterol levels are low in major depressive disorder,but high inschizophrenia，2006年)。矛盾的结果说明瘦素在精神障碍中的作用机制十分复杂，尚需进一步的研究证实。
[0008]根据已有文献的研究，LP基因启动子区甲基化水平变化与多种疾病的发病均有一定程度上的关联，而上述提到目前临床上尚缺乏预测精神分裂症患者出现入睡潜伏期延长的方法，那么是否可以通过设计恰当的PCR扩增引物并检测LP基因启动子甲基化程度的方式来填补空白，从而为预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长的方案提供参考和技术支持，以便完善相关的精神分裂症诊疗方案，则需要本领域技术人员为此开展相应的体系工程研究工作，付出创造性的劳动并进行验证后才能进一步的证实。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种用于实现LP基因启动子PCR扩增的特异性引物，以便检测 LP基因启动子在第65bp与105bp处的CpG2、6位点的甲基化程度，然后根据LP基因启动子甲基化水平变化，可以为设计预测精神分裂症患者入睡潜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于实现LP基因启动子在第65bp与105bp处的CpG2、6位点的甲基化程度检测的特异性引物在制备预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长的药物中的应用，其特征在于，所述的特异性引物包括用于实现LP基因启动子PCR扩增的上游引物和下游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：康毅敏，王鹏翔，李存保，
申请(专利权)人：内蒙古医科大学，
类型：发明
国别省市：