新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用。本发明专利技术人克隆获得了新型的黄酮羟基化酶PhF2H、PhF3’H，其属于细胞色素P450羟基化酶，具有对于化合物特定位置进行羟基化的功能。进一步地，本发明专利技术人通过对于所述酶的改造、结合运用碳苷糖基转移酶、黄酮前体合成途径的组装，在人工重组表达系统中高效地合成了黄酮碳苷类化合物如荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素，及其合成途径中相关的中间体圣草酚、2‑羟基柚皮素等。

【技术实现步骤摘要】
新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用
本专利技术涉及合成生物学及医药
，具体地，本专利技术涉及新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物或其中间体的微生物、其制备方法及其应用。
技术介绍
竹自古以来作为一种药食两用的植物在民间广为流传。《中药大辞典》记载“竹叶清热除烦，生津利尿”指明竹叶的食用价值；而《文经逢源》记载：“竹叶兼行肌表，能疗疮杀虫”亦标明其外用药效；竹叶在江南地区作为一种清热败火茶饮而广为流传。竹叶中最主要的黄酮提取物为四种碳苷黄酮化合物：荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素。碳苷类黄酮化合物是以黄酮C6-C3-C6结构为母核，糖基直接与母核以C-C键相连的化合物。碳苷类黄酮相对于氧苷类黄酮更为稀有，迄今为止从自然界中分离到的碳苷黄酮有几十种，按照黄酮的母体结构可分为碳苷黄酮类、黄酮醇碳苷类、双碳苷黄酮类化合物，而其中以碳苷黄酮类化合物存在最为广泛。根据报道，碳苷黄酮类化合物具有显著的抗氧化作用，可以显著性抑制外源性以及内源性自由基；同时，其具有一定程度抑制细菌病毒的作用；碳苷黄酮类化合物也具有调本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种催化黄烷酮化合物的C-2位或C-3’位羟基化的方法，其特征在于，包括：以新型黄酮羟基化酶进行所述催化；其中，/n所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮化合物的C-2位羟基化；或/n所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮化合物的C-3’位羟基化。/n

【技术特征摘要】
1.一种催化黄烷酮化合物的C-2位或C-3’位羟基化的方法，其特征在于，包括：以新型黄酮羟基化酶进行所述催化；其中，
所述新型黄酮羟基化酶为SEQIDNO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮化合物的C-2位羟基化；或
所述新型黄酮羟基化酶为SEQIDNO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮化合物的C-3’位羟基化。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄烷酮化合物具有式(I)的母核结构，C-2位羟基化后形成式(II)母核结构的化合物，C-3’位羟基化后形成式(III)母核结构的化合物；





3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，A环或B环中，存在1、2或3个羟基。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黄烷酮化合物包括：柚皮素，圣草酚，松属素，橙皮素，樱花素；
C-2位羟基化的产物为2-羟基黄烷酮化合物，包括：2-羟基柚皮素，2-羟基圣草酚，2-羟基松属素，2-羟基橙皮素，2-羟基樱花素；所述黄烷酮化合物的C-2位羟基化后，所形成的2-羟基黄烷酮化合物较佳的为开环形式；或
C-3’位羟基化的产物为3’-羟基黄烷酮化合物，包括：圣草酚，3’-羟基松属素，3’-羟基樱花素。


5.新型黄酮羟基化酶的用途，用于催化黄烷酮化合物的C-2位或C-3’位羟基化，所述新型黄酮羟基化酶为SEQIDNO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮化合物的C-2位羟基化；或
所述新型黄酮羟基化酶为SEQIDNO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮化合物的C-3’位羟基化。


6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述黄烷酮化合物具有式(I)的母核结构，C-2位羟基化后形成式(II)母核结构的化合物，C-3’位羟基化后形成式(III)母核结构的化合物；





7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的黄烷酮化合物包括：柚皮素，圣草酚，松属素，橙皮素，樱花素；
C-2位羟基化的产物包括：2-羟基柚皮素，2-羟基圣草酚，2-羟基松属素，2-羟基橙皮素，2-羟基樱花素；所述黄烷酮化合物的C-2位羟基化后，所形成的2-羟基黄烷酮化合物较佳的为开环形式；
C-3’位羟基化的产物包括：圣草酚，3’-羟基松属素，3’-羟基樱花素。


8.如权利要求1或5所述，其特征在于，所述SEQIDNO:1所示的多肽或其保守性序列变体中，N端的跨膜区氨基酸序列被部分或全部截去；较佳地截去N端第2～24位氨基酸；或
所述SEQIDNO:2所示的多肽或其保守性序列变体中，N端的跨膜区氨基酸序列被部分或全部截去；较佳地截去N端第2～24位氨基酸。


9.如权利要求8所述，其特征在于，还包括在N端添加标签；较佳地，所述标签包括：2B1，17α，MBP；更佳地为2B1标签。


10.如权利要求1～9任一所述，其特征在于，SEQIDNO:1或2的保守性变异多肽包括：
(1)由SEQIDNO:1或2所示序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化黄烷酮化合物的C-2位或C-3’位羟基化功能的多肽；
(2)氨基酸序列与SEQIDNO:1或2所示序列的多肽有80％以上相同性，且具有催化黄烷酮化合物的C-2位或C-3’位羟基化功能的多肽；或
(3)在SEQIDNO:1或2所示序列的多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。


11.一种合成黄酮碳苷化合物或其中间体的方法，其特征在于，包括：
(1)将黄烷酮化合物以新型黄酮羟基化酶进行催化，在其C-2位或C-3’位羟基化；所述新型黄酮羟基化酶为SEQIDNO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮化合物的C-2位羟基化；或，所述新型黄酮羟基化酶为SEQIDNO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮化合物的C-3’位羟基化；
(2)将(1)的C-2位羟基化产物进行碳苷糖基化，获得碳苷-2-羟基黄烷酮化合物；或，将(1)的C-3’位羟基化产物进一步进行C-2位羟基化，之后继续进行碳苷糖基化，获得黄酮碳苷化合物或其中间体。


12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在(1)之前，还包括：(b)将丙二酰-CoA结构类似物与p-香豆酰-CoA结构类似物经查尔酮合成酶和查尔酮异构酶催化，获得黄烷酮化合物。


13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在(b)之前，还包括：(a)将芳香族氨基酸经...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，孙雨伟，陈卓，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：上海;31