一种提高竹红菌甲素产率的生物学方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种提高竹红菌甲素产率的生物学方法，其包括如下步骤：步骤1）菌株活化，步骤2）制备种子液，步骤3）发酵培养，步骤4）诱导培养。本发明专利技术通过对发酵培养条件进行改进，优化了竹红菌甲素的合成途径，从而达到了提高竹红菌甲素产率的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种提高竹红菌甲素产率的生物学方法
本专利技术属于光化疗药物竹红菌甲素的生物生产
，特别涉及一种提高竹红菌甲素产率的生物学方法。
技术介绍
竹黄是我国传统的药用真菌，具有止咳祛痛、舒筋活络、祛风利湿、补中益气、活血补血和散瘀通经等功效。竹黄次生代谢产物中竹红菌素和痂囊腔菌素含量较高，竹红菌素包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素，都属于苝醌类化合物。苝醌类化合物作为良好的光敏剂,具有不同程度的抗癌活性和抑制病毒活性，其中竹黄发酵料中竹红菌甲素(HypocrellinA，简称HA)含量较多。竹红菌甲素是目前已知可见光区内优良光敏剂，光敏可产生单重态氧，在无氧条件下可产生半醌负离子，对有机体、细胞和病毒具有伤害能力，都是非常具有开发价值的天然药物。竹红菌甲素具有光敏产生各种活性氧的能力。与目前已经商品化的光敏剂(如血卟啉类衍生物)相比，其具有易得、易纯化、化学修饰性好、三重态量子产率高、单重态氧量子产率高、光毒性高、体内代谢快等优点，在光动力抗艾滋病毒、治疗肿瘤和微血管类疾病等方面有广泛的潜在应用价值。天然竹红菌甲素主要提取自竹黄菌和竹红菌，但是其产量稀少且不稳定，季节性强，无法满足医药、食品等市场对色素日益增长的需求。竹红菌色素的生产方法还有人工化学合成法。化学从头合成一般要经历多步反应步骤，合成和分离的成本过高。微生物发酵法具有绿色、产物分离简单和不受季节影响等的优点，是生产竹红菌色素最有前景的方法之一。菌种和发酵工艺控制是发酵生产竹红菌色素的核心技术。目前，野生竹黄提取生产竹红菌素已经无法满足人类的需求，且不利于竹黄菌资源保护与可持续利用，因此竹黄菌液态深层发酵成了生产竹红菌素的首选。目前提高竹黄菌发酵产竹红菌甲素量的方法包括有选育高产菌株、优化培养条件、添加诱导刺激物等。现有技术对生物发酵法生产竹红菌素进行了较多的研究，主要例举如下：文献1，竹黄菌发酵生产竹红菌素的研究进展，生物加工过程2016年，对多种发酵培养条件进行了表述，其中，固体发酵中，竹红菌素的最大产量为40mg/kg，但是没有公开竹红菌甲素的产量。文献2，InductionofhypocrellinproductionbyTritonX-100undersubmergedfermentationwithShiraiasp．SUPEＲ-H168.NewBiotechnol，2011年，该文献筛选了高产菌株Shiraiasp.SUPEＲH168，发现固态发酵可以高产竹红菌素，而普通液体培养基培养均没有产生竹红菌素，将一定体积分数的不同表面活性剂加入液体培养基进行对比，发现加入0.6%TritonX-100后竹红菌素的产量为780.6mg/L，发酵周期为3d，比固态发酵和一般报道的液态发酵周期要短，且产量高；还添加了Tween40、Tween80、TritonX-114和十二烷基磺酸钠(SDS)，均没有明显增加竹红菌素的产量；同样，该文献也没对竹红菌甲素进行进一步的研究。文献3，竹黄菌液体培养下产竹红菌素的研究，广西植物2012年，先对不同产地采集的竹黄菌进行筛选，得到优产竹红菌素的菌株，然后采用正交试验法对竹红菌素液体发酵条件进行优化，在优化培养基的基础上，选用不同浓度的Ｃｒ３＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋和Ｃａ２＋对竹红菌素进行离子调控研究。结果表明：竹红菌素最佳发酵碳源是葡萄糖，最佳发酵氮源是硝酸钠，最佳培养基组合为葡萄糖+硝酸钠，Ｃｒ３＋和Ｆｅ３＋浓度为０.００５％时竹红菌素含量均最高；０.０５％的Ｃａ２＋最有利于竹红菌素的分泌；Ｃｕ２＋为０.０３％时竹红菌素含量达到最大值；其中，竹红菌素的含量最大为8mg/g菌体，菌体干重最大可达到10g/L。该文献同样也没对竹红菌甲素进行研究。现有文献中专门针对竹红菌甲素进行研究的较少，文献4“CN110172409A”从产自中国浙江的竹黄子实体上分离得到的野生型菌株，该菌株以甘油为最适碳源，在最适条件下，生产竹红菌甲素的产率最高可达到20mg/g菌丝体，竹红菌甲素在总色素中的含量较高，具备一定的工业应用价值。鉴于竹红菌甲素带来的较高的医药使用价值，如何通过研究竹红菌甲素的合成机制来优化生物法发酵生产竹红菌甲素的工艺技术是我们共同的技术诉求。
技术实现思路
针对现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种提高竹红菌甲素产率的生物学方法，通过对发酵培养条件进行改进，优化了竹红菌甲素的合成途径，从而达到了提高竹红菌甲素产率的目的。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种提高竹红菌甲素产率的生物学方法，其包括如下步骤：步骤1）菌株活化，步骤2）制备种子液，步骤3）发酵培养，步骤4）诱导培养。进一步地，所述生物学方法包括如下步骤：步骤1）菌株活化：将保存在斜面培养基上的竹黄菌进行活化24-48h；步骤2）制备种子液：取菌丝块，打碎，接入到液体种子培养基中进行震荡培养，培养温度为25-28℃，收集种子液；步骤3）发酵培养：将种子液按照5-10%的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养36-48h，温度为27℃，转速为150rpm，通气量为0.6VVM；步骤4）诱导培养：继续添加诱导培养基，诱导培养时间为24-48h，温度为27-30℃，转速为150rpm，通气量为0.7VVM；停止发酵，收集发酵液。优选地，所述诱导培养基和发酵培养基的体积比例为1-2:10。优选地，所述发酵培养基组分为：可溶性淀粉50g/L,氯化铵7g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁0.2g/L，pH自然。优选地，所述液体种子培养基的组分为：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，pH自然。优选地，所述诱导培养基的组分为：硝酸钙8-15g/L，甲醇75-125g/L。更优选地，所述诱导培养基和发酵培养基的体积比例为1:6。更优选地，所述诱导培养基的组分为：硝酸钙14g/L，甲醇100g/L。更优选地，所述诱导培养的温度优选为30℃。与现有技术进行比较，本专利技术取得的有益的技术效果主要包括但是并不限于以下几个方面：本专利技术针对竹红菌甲素的合成途径，通过培养条件的优化来提升甲素的产量，可控性强，能耗降低。目前，已有研究在发酵培养初期添加钙离子，本专利技术针对竹红菌甲素的合成机制，通过试验进行验证钙离子的添加时机和浓度，研究表明，在发酵中后期添加钙离子，对甲素的正向调控效果更佳，明显优于发酵初期添加钙离子。本专利技术采用二次添加诱导培养基的方式，甲醇会引起菌株对其的防御反应而产生胁迫，进而提高细胞内细胞色素C过氧化物酶和活性氧的水平，从而诱导胞内甲素类代谢物的合成。与其他醇类相比较，甲醇的效果更佳，可能原因是甲醇还能够提供甲素合成过程中所需的甲氧基。发酵中后期，次级代谢物合成迅速，此时适当提升发酵温度，会对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高竹红菌甲素产率的生物学方法，其包括如下步骤：/n步骤1）菌株活化，步骤2）制备种子液，步骤3）发酵培养，步骤4）诱导培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高竹红菌甲素产率的生物学方法，其包括如下步骤：
步骤1）菌株活化，步骤2）制备种子液，步骤3）发酵培养，步骤4）诱导培养。


2.根据权利要求1所述的生物学方法，其特征在于，所述生物学方法包括如下步骤：
步骤1）菌株活化：将保存在斜面培养基上的竹黄菌进行活化24-48h；
步骤2）制备种子液：取菌丝块，打碎，接入到液体种子培养基中进行震荡培养，培养温度为25-28℃，收集种子液；
步骤3）发酵培养：将种子液按照5-10%的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养36-48h，温度为27℃，转速为150rpm，通气量为0.6VVM；
步骤4）诱导培养：继续添加诱导培养基，诱导培养时间为24-48h，温度为27-30℃，转速为150rpm，通气量为0.7VVM；停止发酵，收集发酵液。


3.根据权利要求1-2所述的生物学方法，其特征在于，所述诱导培养基和发酵培养基的体积比例为1-2:10。


4.根据权利要求1-2所述的生物学方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘加林，霍萧勇，刘加海，方朝杰，张渊源，
申请(专利权)人：杭州巴洛特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33