一种靶向赖氨酰氧化酶1的嵌合抗原受体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及靶向赖氨酰氧化酶1的嵌合抗原受体及其用途，具体提供给了一种分离的嵌合抗原受体，其包含抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域，所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域为包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区1‑3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区1‑3。本发明专利技术还提供了一种免疫效应细胞，其包含本发明专利技术所述的嵌合抗原受体。本发明专利技术的免疫效应细胞具有显著抑制肿瘤的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向赖氨酰氧化酶1的嵌合抗原受体及其用途
本专利技术涉及生物技术和生物医药领域，具体的涉及一种靶向赖氨酰氧化酶1的嵌合抗原受体及其用途。
技术介绍
1.1乳腺癌乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率在全球范围内居于恶性肿瘤首位，也是死亡率最高的恶性肿瘤之一。根据美国癌症协会报道，2008年全球有超过138万女性罹患乳腺癌，占女性癌症新发病例数的23％，有超过45万人死于乳腺癌，占癌症死亡总人数的14％，且发达国家如西欧和北美等地区乳腺癌的发病率高于欠发达国家。2016年美国预计癌症新发病例数约为168.5万，癌症死亡例数为59.5万，其中乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，新发病例约为24.6万，占女性恶性肿瘤总发病例的29％；约4.05万人死于该病，占女性癌症死亡人数的14％。而在我国，乳腺癌的发病率近年来呈明显上升趋势。在1998年至2007年间，城市妇女和农村妇女的乳腺癌发病率年增长分别为3.9％和6.3％。根据中国抗癌协会公布的统计数字显示，我国每年新发乳腺癌病例约21万，发病率以每年3％的速度递增，在北京、上海、天津、广州等大城市已位居首位。从1991年至2000年间，我国乳腺癌患者死亡率增长了38.9％，成为死亡率增长最快的恶性肿瘤，已然成为了妇女健康的最大威胁。乳腺癌早已是一种公认的全身性疾病，治疗主要是系统性的多学科综合治疗，包括手术治疗、辅助放化疗、生物靶向治疗及内分泌治疗。随着乳腺钼靶X线摄片检查的普及、外科手术新技术的开展、放化疗技术的更新以及生物靶向治疗的推广等，乳腺癌的治疗已经取得了巨大进步，其治愈率得到了显著改善。但由于乳腺癌是一种具有高度异质性的恶性肿瘤，仍然使我们在治疗中面临着很大的困难，即使是早期乳腺癌患者，仍约有30％的患者治疗失败、出现转移。转移是乳腺癌患者死亡的首要原因，一旦发生复发转移，治愈率低于5％，预后不佳。因此，怎样针对乳腺癌的复发和转移进行有效的靶向治疗，对提高乳腺癌患者生存率和生活质量、改善预后具有重要实际意义。1.2赖氨酰氧化酶(LysylOxidase，LOX)LOX是一种铜(Cu)依赖的氨基氧化酶，其基因位于人类常染色体5q23.1，由七个外显子和六个内含子组成。LOX是一种在细胞外基质形成和修复过程中起着重要作用的基质重塑酶，是细胞外基质中胶原与弹力蛋白聚合起始阶段稳定细胞外基质的关键酶。在Cu2+的辅助下，LOX能氧化细胞外基质中的胶原蛋白和弹性蛋白上特殊的氨基酸残基并使两者形成共价交联，调节组织的抗张强度、抵抗胶原酶的水解。LOX与配体结合后，在多种靶细胞内发挥生物学效应，包括调控细胞信号传导与基因转录，影响细胞运动迁移与细胞粘附等。近年来，越来越多的学者通过研究发现赖氨酰氧化酶1(LOX-1)与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关。LOX-1在癌细胞中的过表达可促使其具有侵袭性，并可抗癌细胞失巢凋亡，增加其运动能力和侵袭性，而LOX-1反义寡核苷酸能够抑制癌细胞的侵袭转移能力。有研究发现，LOX-1蛋白在乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁正常乳腺组织及乳腺良性病变组织、在有腋窝淋巴结转移的乳腺癌高于无腋窝淋巴结转移者。韦薇等通过建立乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，接种转染LOX-RNAi-LV的MDA-MB-231细胞于裸鼠，待成瘤后测量移植瘤的体积和质量并进行对比，发现干扰MDA-MB-231乳腺癌细胞中LOX-1的表达可抑制乳腺癌裸鼠移植瘤的生长及侵袭。1.3嵌合抗原受体T细胞免疫治疗技术嵌合抗原受体T细胞免疫治疗技术也称CAR-T细胞治疗。CAR-T全称ChemericAntigenreceptorT-cellImmunotherapy，是将针对特定肿瘤的抗原的抗体与T细胞内的CD3ζ、FcεRIγ相结合后在患者T细胞上表达并进行体外扩增、筛选，并大量回输入患者体内。基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，这是一种细胞疗法。CARs由T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)的胞内信号区(如CD3ζ和CD28)、跨膜区以及胞外抗原结合区组成。重组的CARs依赖抗原，但不依赖MHC的呈递，有效避免了MHC下调这一免疫逃逸机制。根据胞内信号域结构的差异，CAR可划分为四代，第一代CAR结构只有一个胞内信号组分(TCR/CD3ζ链和FcεRIγ链)，能够识别靶抗原并激活T细胞，无共刺激分子，不能转导增殖信号和诱导细胞因子产生，T细胞无法增殖，因而杀伤肿瘤效果甚微。第二代CAR细胞内增加了一个共刺激分子，如CD28、CD27、41BB(CD137)、OX40(CD134)或者可诱导共刺激分子(inducibleco-stimulatorymolecule，ICOS)，即便没有外源性共刺激分子T细胞也能持续增殖并释放细胞因子。虽然二代CAR大大提高了T细胞抗肿瘤疗效，但仍未全面开启T细胞的杀伤能力，于是诞生了包含两个共刺激分子(CD28、4-1BB和CD3ζ)的第三代CAR。小鼠实验表明三代CAR能够增强细胞因子的分泌、抑制肿瘤生长。由于受实体瘤中微环境复杂，免疫逃逸机制多样，肿瘤抗原靶点繁杂，且实体瘤体积大、CAR-T细胞难以归巢到肿瘤组织等多方面因素的影响，CAR-T在实体瘤的治疗实践中仍有部分障碍。卵巢癌是预后最差的妇科恶性肿瘤，近半个世纪以来其临床诊治无突破性进展，是最早尝试CAR-T治疗的实体瘤之一。二、三代CAR-T现处于临床研发中。目前世界范围内正在进行针对不同实体瘤抗原靶点的CAR-T细胞多中心临床研究，具有代表性的抗原靶点还包括：mesothelin用于治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌；CEA用于治疗肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌；MUC-1用于治疗肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌；GPC3用于肝癌；EGFR-vIl用于神经胶质瘤、头颈部肿瘤；PSMA用于前列腺癌等。目前，随着CAR-T技术在血液肿瘤中的成功应用，CAR-T细胞技术进入了一个崭新的时代，也为肿瘤患者带来了新的希望。然而，尽管CAR-T细胞在血液肿瘤中显示了良好的治疗效果，但在实体瘤的应用中还面临诸多困难，如缺乏特异性的靶点、CAR-T细胞不能有效浸润入肿瘤组织和免疫抑制性微环境对CAR-T细胞的抑制性作用等。CAR-T细胞治疗的最终目标是治愈肿瘤，因此寻找新型高特异性的肿瘤表面抗原靶点或选择多个靶点进行治疗，可以促进CAR-T细胞向肿瘤组织的迁移浸润，解除肿瘤微环境的免疫抑制性，提高CAR-T细胞在实体瘤中的抗肿瘤效果。
技术实现思路
本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含SEQID.1所示的氨基酸序列，本专利技术还提供编码所述嵌合抗原受体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述嵌合抗原受体、所述核酸分子和/或所述载体的免疫效应细胞、制备所述免疫效应细胞的方法、包含所述免疫效应细胞的组合物以及所述嵌合抗原受体的用途。本专利技术所述的嵌合抗原受体至少包含以下一种有益效果：(1)在免疫细胞(例如，T细胞)表面稳定表达，表达量高；(2)具有较强的杀伤LOX-1阳性靶细胞的能力；(3)促进免疫细胞分泌细胞因子，例如，使T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的嵌合抗原受体，其特征在于，其包含抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域，所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域为包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3，其中，/n轻链互补决定区1序列如SEQ ID No.4所示；/n轻链互补决定区2序列如SEQ ID No.6所示；/n轻链互补决定区3序列如SEQ ID No.8所示；/n重链互补决定区1序列如SEQ ID No.11所示；/n重链互补决定区2序列如SEQ ID No.13所示；/n重链互补决定区3序列如SEQ ID No.15所示；/n优选地，所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域包含抗赖氨酰氧化酶1的单链可变片段；/n更优选地，所述抗赖氨酰氧化酶1的单链可变片段系列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的嵌合抗原受体，其特征在于，其包含抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域，所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域为包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3，其中，
轻链互补决定区1序列如SEQIDNo.4所示；
轻链互补决定区2序列如SEQIDNo.6所示；
轻链互补决定区3序列如SEQIDNo.8所示；
重链互补决定区1序列如SEQIDNo.11所示；
重链互补决定区2序列如SEQIDNo.13所示；
重链互补决定区3序列如SEQIDNo.15所示；
优选地，所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域包含抗赖氨酰氧化酶1的单链可变片段；
更优选地，所述抗赖氨酰氧化酶1的单链可变片段系列如SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的分离的嵌合抗原受体，其特征在于，细胞内信号传导结构域中包含基础信号传导结构域，所述基础信号传导结构域选自CD3ζ、TCRζ、FcRIγ、FcRIβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d中的至少一种；
优选地，细胞内信号传导结构域中包含还包含至少一种共刺激分子结构域，所述共刺激分子选自4-1BB、CD28、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、B7-H3、ICOS、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1、SLAMF4、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、Ly9、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、SELPLG、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB...

【专利技术属性】
技术研发人员：代小勇，苏明，
申请(专利权)人：海南精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46