基于sanger测序的SMA检测方法技术

本发明专利技术涉及基因测序技术领域，具体涉及基于sanger测序的SMA检测方法，包括如下步骤，a、取待检测样本DNA，明确其SMN1基因第7号外显子第480号碱基染色体位；b、获取待检测样本DNA的SMN1基因第480号碱基位置前后的核苷酸序列；c、利用Primer Premier 5软件，针对步骤b中获得的核苷酸序列设计sanger引物组；d、对待检测样本DNA进行PCR扩增；e、对d的产物进行sanger测序，得到待检测样本DNA的SMN1基因第7号外显子第480号碱基C/T比值范围区间；f、将步骤e中的测序结果进行比对，以确定待检测样本是否为SMA携带者。本发明专利技术提供一种操作流程简便、检测成本低廉、无需凑样、检测周期短、检测结果准确度高。

【技术实现步骤摘要】
基于sanger测序的SMA检测方法
本专利技术涉及基因测序
，特别是涉及基于sanger测序的SMA检测方法。
技术介绍
脊髓性肌萎缩症（Spinalmuscularatrophy，SMA）又称为“进行性脊肌萎缩症”，是常染色体隐性遗传的神经肌肉疾病，特征为脊髓前角细胞变性，导致对称性肌无力和萎缩。该疾病是最常见的常染色体隐性遗传疾病之一，是导致儿童死亡的最常见遗传原因，在6000–10,000例活产中会发生1例，在亚洲人群中发病率为1：8009，携带率为1：48。该疾病根据发病年龄的不同可分为，SMA0型、SMAI型、SMAII型、SMAIII型、SMAIV型。SMA0型，患病婴儿在子宫内活动减少，出生时有严重的肌无力，肌张力低下和呼吸窘迫等症状。SMAI型，在6个月之前发病，平均发病年龄为2.5个月，主要临床表现为近端对称肌肉无力、缺乏运动发育、深层腱反射减弱或缺失以及肌张力差。婴儿可能会有头部控制能力，但很快又消失。SMAII型，发病年龄为6-12个月之间，平均发病年龄为8.3个月，主要临床表现为不能独立站立或行走、手部震颤，深肌腱反射减弱至消失。SMAIII型（也称为Kugelberg-Welander病），发病年龄在18个月以后，患者可以独立行走，但多数人会逐渐丧失这种能力，该类型患者心脏和认知功能通常正常。SMAIV型，通常在生命的第二个或第三个十年出现肌肉无力，心脏、认知功能及预期寿命是正常的，SMAIV是最不常见的SMA形式，仅影响不到5％的SMA患者。现在技术中有多种检测SMA（脊髓性肌萎缩症）的遗传学方法，如多重链接探针扩增（MLPA）、实时定量基因扩增荧光检测系统（qPCR）、聚合酶链反应-限制性酶片段长度多态性（PCR-RFLP）等，这些检测方法存在流程上比较繁琐、或是检测成本比较昂贵、或是需要等待凑样本检测，检测周期长等问题。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种操作流程简便、检测成本低廉、无需凑样、检测周期短、检测结果准确度高的基于sanger测序的SMA检测方法。本专利技术所采用的技术方案是：基于sanger测序的SMA检测方法，包括如下步骤，a、取待检测样本DNA，明确其SMN1基因第7号外显子第480号碱基染色体位；b、获取待检测样本DNA的SMN1基因第480号碱基位置前后的核苷酸序列；c、利用PrimerPremier5软件，针对步骤b中获得的核苷酸序列设计sanger引物组；d、对待检测样本DNA进行PCR扩增；e、对d的产物进行sanger测序，得到待检测样本DNA的SMN1基因第7号外显子第480号碱基C/T比值范围区间；f、将步骤e中的测序结果进行比对，以确定待检测样本是否为SMA携带者；对上述技术方案的进一步改进为，步骤a中，对染色体位的明确通过查阅ClinVar数据库获知。对上述技术方案的进一步改进为，步骤b中，通过UCSC数据库，获取的核苷酸序列为待检测样本SMN1基因第480号碱基位置前后500bp的核苷酸序列。对上述技术方案的进一步改进为，步骤c中，sanger引物组为F(正向）：5’-TGTCTTGTGAAACAAAATGCTTT-3’R(反向）：5’-TGCTGGTCTGCCTACTAGTGATA-3’。对上述技术方案的进一步改进为，步骤e中，通过Bio-Trace-ABIF软件得到待检测样本的SMN1基因第7号外显子第480号碱基C/T比值范围区间。对上述技术方案的进一步改进为，步骤f中，若第480号碱基显示T单峰，则待检测样本为exon7纯合缺失的SMA患者；若第480号碱基显示CT单峰，且C/T峰高比值为0.8-1.2时，待检测样本为正常人群；若第480号碱基显示CT单峰，且C/T峰高比值为0.1-0.6时，待检测样本为exon7杂合缺失的SMA患者。对上述技术方案的进一步改进为，还包括对检测结果进行验证，所述验证方法为MLPA验证。本专利技术的有益效果为：一方面，在进行SMA检测时，主要针对SMN1基因，这是由于SMA是由位于染色体5q13上的存活运动神经元（SMN）基因的缺失或突变引起的，该基因存在两个几乎相同的拷贝，即SMN1和SMN2。SMN1基因和SMN2基因高度同源，SMN1和SMN2基因在DNA水平上只有5个碱基不同。在编码区只有2个碱基不同，其中7号外显子中第480号碱基（以下简称c.480）最关键。大约95%-98%的SMA患者是由SMN1基因的外显子7号和或8的纯合缺失所致，约2%-5%的SMA患者是由SMN1基因位点变异的纯合或与7号外显子的缺失组成复合杂合所致，而SMN2的缺失并不会引起SMA。针对SMN1基因7号外显子纯合缺失、杂合缺失检测，可以有效区分SMA患者、携带者与正常人群。第二方面，利用SMN1和SMN2基因在第7号外显子上第480号核苷酸序列不同，如图1所示，SMN1基因c.480为C碱基，SMN2基因c.480为T碱基。第三方面，采用自主设计引物，使得引物序列可以同时匹配到SMN1和SMN2基因的c.480左右区域。通过sanger测序，结合c.480峰图从而分析结果。第四方面，为了更精准识别SMA携带者与正常人群，本专利技术首创采用c.480号碱基CT峰高信号值比值来识别是否存在SMN1基因exon7杂合缺失。采用回溯分析方法：已用MLPA方法明确的30个正常人群与30个SMAexon7杂合缺失携带者，通过自主设计的引物，进行sanger测序。将sanger测序的信号通过Bio-Trace-ABIF软件，识别出c.480号碱基C/T峰高值。通过正常人群与携带者c.480号碱基C/T峰高比值统计学分析，明确正常人群的SMN1基因c.480号碱基C/T比值范围区间为：0.8-1.2；而SMA携带者（携带SMN1基因exon7杂合缺失）c.480号碱基C/T比值范围区间为：0.1-0.6。第五方面，本专利技术操作流程简便、检测成本低廉、无需凑样、检测周期短，可为SMA疾病分子诊断提供更合适的检测策略。附图说明图1为SMN1和SMN2基因在第7号外显子上第480号核苷酸序列对比图；图2为本专利技术的检测原理图；图3为本专利技术的实施例的实验流程图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术作进一步的说明。如图1所示，为本专利技术的检测原理图。基于sanger测序的SMA检测方法，包括如下步骤，a、取待检测样本DNA，查阅ClinVar数据库，明确其SMN1基因第7号外显子第480号碱基染色体位【chr5:70247773（GRCh37）】；b、通过UCSC数据库，获取待检测样本DNA的SMN1基因第480号碱基位置前后500bp的核苷酸序列；c、利用PrimerPremier5软件，针对步骤b中获得的核苷酸序列设计sanger引物组，F(正向）：5’-TGTCTTGTGAAACAAAATGCTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于sanger测序的SMA检测方法，其特征在于：包括如下步骤，/na、取待检测样本DNA，明确其SMN1基因第7号外显子第480号碱基染色体位；/nb、获取待检测样本DNA的SMN1基因第480号碱基位置前后的核苷酸序列；/nc、利用Primer Premier 5软件，针对步骤b中获得的核苷酸序列设计sanger引物组；/nd、对待检测样本DNA进行PCR扩增；/ne、对d的产物进行sanger测序，得到待检测样本DNA的SMN1基因第7号外显子第480号碱基C/T比值范围区间；/nf、将步骤e中的测序结果进行比对，以确定待检测样本是否为SMA携带者。/n２.根据权利要求1所述的基于sanger测序的SMA检测方法，其特征在于：步骤a中，对染色体位的明确通过查阅ClinVar数据库获知。/n３.根据权利要求1所述的基于sanger测序的SMA检测方法，其特征在于：/n步骤b中，通过UCSC数据库，获取的核苷酸序列为待检测样本SMN1基因第480号碱基位置前后500bp的核苷酸序列。/n４.根据权利要求1所述的基于sanger测序的SMA检测方法，其特征在于：步骤c中，sanger引物组为/nF(正向）：5’-TGTCTTGTGAAACAAAATGCTTT-3’/nR(反向）：5’-TGCTGGTCTGCCTACTAGTGATA-3’。/n５.根据权利要求1所述的基于sanger测序的SMA检测方法，其特征在于：/n步骤e中，通过Bio-Trace-ABIF软件得到待检测样本的SMN1基因第7号外显子第480号碱基C/T比值范围区间。/n６.根据权利要求1所述的基于sanger测序的SMA检测方法，其特征在于：/n步骤f中，若第480号碱基显示T单峰，则待检测样本为exon7纯合缺失的SMA患者；若第480号碱基显示CT单峰，且C/T峰高比值为0.8-1.2时，待检测样本为正常人群；若第480号碱基显示CT单峰，且C/T峰高比值为0.1-0.6时，待检测样本为exon7杂合缺失的SMA患者。/n７.根据权利要求1所述的基于sanger测序的SMA检测方法，其特征在于：还包括对检测结果进行验证，所述验证方法为MLPA验证。/n...

【技术特征摘要】
1.基于sanger测序的SMA检测方法，其特征在于：包括如下步骤，
a、取待检测样本DNA，明确其SMN1基因第7号外显子第480号碱基染色体位；
b、获取待检测样本DNA的SMN1基因第480号碱基位置前后的核苷酸序列；
c、利用PrimerPremier5软件，针对步骤b中获得的核苷酸序列设计sanger引物组；
d、对待检测样本DNA进行PCR扩增；
e、对d的产物进行sanger测序，得到待检测样本DNA的SMN1基因第7号外显子第480号碱基C/T比值范围区间；
f、将步骤e中的测序结果进行比对，以确定待检测样本是否为SMA携带者。
２.根据权利要求1所述的基于sanger测序的SMA检测方法，其特征在于：步骤a中，对染色体位的明确通过查阅ClinVar数据库获知。
３.根据权利要求1所述的基于sanger测序的SMA检测方法，其特征在于：
步骤b中，通过UCSC数据库，获取的核苷酸序列为待检测样本SMN1基因第480号碱基位置前后500bp的核苷酸序列。
４.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁丽丝，曹延昆，黄佳燕，陈样宜，刘远如，焦伟刚，
申请(专利权)人：广东博奥医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44