一种基于血清外泌体miRNA的PD诊断及分期试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于血清外泌体miRNA的PD诊断及分期试剂盒。通过检测PD患者特定序列的miRNA的表达量水平，识别PD的不同发病阶段，例如Ⅱ期等早期阶段，从而能够尽早采取治疗手段防止疾病进一步恶化。本发明专利技术采用的PD诊断及分期标志物的来源为外泌体miRNA，与常用于检测的外周循环miRNA相比，具有稳定性高、敏感性强，特异性好的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于血清外泌体miRNA的PD诊断及分期试剂盒
本专利技术涉及疾病诊断筛查试剂，具体涉及使用血清外泌体miRNA进行PD诊断及分期。
技术介绍
帕金森病(PD)是一种发病隐匿、危害严重的神经退行性疾病(NDDs)，至出现明显症状时DA神经元已不可逆丢失达70％左右，所以对PD进行早期诊断至关重要。实时逆转录定量PCR(qRT-PCR)是一种主要用于检测各种样品中特定核酸相对表达量的方法，具有检测范围宽、敏感度和精度高，且避免交叉污染的特点，尤其适合在样品量少的情况下完成检测，在各种NDDs的诊断方面均得到了广泛应用。miRNA是一类由18～25个核苷酸组成的非编码单链小分子RNA。多项研究表明，外周血miRNA在不同NDDs中的水平变化已成为揭示其发展阶段的重要指标之一，但是循环miRNA容易受到外周循环系统中丰富的RNA酶(RNase)的降解作用的影响，不能准确反映中枢神经系统(CNS)的状态，导致从循环miRNA中筛选可用于临床诊断的标志物存在一定困难。外泌体是一种几乎所有机体细胞都能分泌、直径大小为30～150nm的细胞外囊泡(EVs)，在脑脊液、血液等体液中均可发现。miRNA可从细胞中运送出来，并包裹进外泌体(即形成外泌体miRNA)和Argonaute2蛋白等载体内，作为细胞间信息传递的信使。外泌体miRNA(ex-miRNA)可在多种NDDs的诊断中发挥重要作用，相对循环miRNA而言，ex-miRNA主要具有以下优势：(1)miRNA在外泌体中的平均含量(42％～48％)比在血浆中的平均含量(30％)高；(2)外泌体可以富集并稳定miRNA，避免miRNA被外周循环系统中存在的RNase降解；(3)外泌体可以自由穿越血脑屏障，直观反映中枢神经系统的状态变化；(4)外泌体RNA的提取和测序、定量技术成熟。中国专利CN110872628A公开了胞外囊泡的生物标记，例如hsa-miR-199a-3p等在癌症诊断中的用途，其同时指出胞外囊泡的生物标记，例如细胞因子、exoDNA的表达水平可以用于确定PD等退化性疾病处于老化状态。目前根据序列相似性预测miRNA的生物功能尚无实验依据，也未见到使用来源于血清外泌体的miRNA进行PD早期诊断的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于血清外泌体miRNA的PD诊断及分期试剂盒，解决了现有技术中尚无法利用miRNA对PD进行分期以实现早期诊断的难题。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种PD诊断试剂盒，包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量PCR引物(例如，SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2)，所述标志物为hsa-miR-374a-5p和/或hsa-miR-374b-5p。一种PD患者分期(Ⅱ期)试剂盒，包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量PCR引物(例如，SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5)，所述标志物为hsa-miR-199a-3p和/或hsa-miR-195-5p。一种PD患者分期(Ⅲ期)试剂盒，包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量PCR引物(例如，SEQ.ID.NO.6)，所述标志物为hsa-miR-28-5p。一种PD患者分期(Ⅳ期)试剂盒，包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量PCR引物(例如，SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.7)，所述标志物为hsa-miR-22-5p和/或hsa-miR-151a-5p。一种PD诊断及分期试剂盒，包括用于对hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-374b-5p中任意一种或两种标志物的表达水平进行检测的实时定量PCR引物，以及用于对hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-151a-5p中任意一种或多种标志物的表达水平进行检测的实时定量PCR引物。优选的，以上各标志物提取自外周血。优选的，所述外周血采样量为5～15mL/个体(例如，9～11mL/个体)。优选的，以上各标志物提取自外周血中的血清外泌体。以上作为标志物的miRNA(hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-151a-5p)及其反转录本在制备PD早期诊断试剂盒、试剂中的应用。以上作为标志物的miRNA(hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-151a-5p)及其反转录本在制备PD患者分期试剂盒、试剂中的应用。以上实时定量PCR引物(序列如SEQ.ID.NO.1～SEQ.ID.NO.7所示的实时定量PCR扩增反应特异引物)在制备PD早期诊断试剂盒、试剂中的应用。优选的，所述试剂盒还包括实时定量PCR扩增反应通用引物以及内参序列扩增引物(例如，SEQ.ID.NO.8和SEQ.ID.NO.9)。以上实时定量PCR引物(序列如SEQ.ID.NO.1～SEQ.ID.NO.7所示的实时定量PCR扩增反应特异引物)在制备PD患者分期试剂盒、试剂中的应用。优选的，所述试剂盒还包括实时定量PCR扩增反应通用引物以及内参序列扩增引物(例如，SEQ.ID.NO.8和SEQ.ID.NO.9)。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术可通过检测PD患者特定序列的miRNA的表达量水平，识别PD的不同发病阶段(例如，Ⅱ期等早期阶段)，从而能够尽早采取治疗手段防止疾病进一步恶化。进一步的，本专利技术采用的PD诊断及分期标志物的来源为外泌体miRNA，与常用于检测的外周循环miRNA相比，具有稳定性高、敏感性强，特异性好的优点。附图说明图1为不同个体外泌体miRNA表达情况：A.hsa-miR-374a-5p；B.hsa-miR-374b-5p；*表示p<0.05，****表示p<0.0001；stage2\3\4对应表示Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。图2为不同个体外泌体miRNA表达情况：A.hsa-miR-199a-3p；B.hsa-miR-195-5p的表达情况；*表示p<0.05，**表示p<0.001，****表示p<0.0001；stage2\3\4对应表示Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。图3为不同个体外泌体miRNA(hsa-miR-28-5p)表达情况：****表示p<0.0001；stage2\3\4对应表示Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。图4为不同个体外泌体miRNA表达情况：A.hsa-miR-22-5p；B.hsa-miR-151a-5p；****表示p<0.0001；stage2\3\4对应表示Ⅱ、Ⅲ、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PD诊断及分期试剂盒，其特征在于：包括用于对hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-374b-5p中任意一种或两种标志物的表达水平进行检测的实时定量PCR引物，以及用于对hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-151a-5p中任意一种或多种标志物的表达水平进行检测的实时定量PCR引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种PD诊断及分期试剂盒，其特征在于：包括用于对hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-374b-5p中任意一种或两种标志物的表达水平进行检测的实时定量PCR引物，以及用于对hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-151a-5p中任意一种或多种标志物的表达水平进行检测的实时定量PCR引物。


2.一种PD诊断试剂盒，其特征在于：包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量PCR引物，所述标志物为hsa-miR-374a-5p和/或hsa-miR-374b-5p。


3.一种PD患者分期试剂盒，其特征在于：包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量PCR引物，所述标志物为hsa-miR-199a-3p和/或hsa-miR-195-5p。


4.一种PD患者分期试剂盒，其特征在于：包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量PCR引物，所述标志物为hsa-miR-28-5p。


5.一种PD患者分期试剂盒，其特征在于：包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量PCR引物，所述标志物为hsa-miR-22-5p和/或hsa-miR-151a-5p。

【专利技术属性】
技术研发人员：杨倩，贺舒磊，陈伯林，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61