一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂及其制备方法与应用，属于医药技术领域。本发明专利技术通过提取荷瘤小鼠的肿瘤组织，并处理加工形成肿瘤细胞膜囊泡，经化学修饰后形成可在肿瘤组织中原位形成凝胶的凝胶因子，在共载细胞周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)抑制剂和外泌体抑制剂后，可以有效的调控肿瘤细胞和肿瘤外泌体PD‑L1，从而同时解除局部和系统性免疫抑制，因此具有良好的实际应用之价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂及其制备方法与应用
本专利技术属于医药
，具体涉及一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂及其制备方法与应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。通常认为程序性死亡1配体(PD-L1)在肿瘤细胞表面上起作用，然而基于PD-L1阻断的免疫疗法临床病例中失败率仍然很高。当前增强基于PD-L1的疗法的反应效率的方法仅限于局部调节肿瘤部位，例如增加肿瘤的免疫原性和重塑肿瘤的免疫微环境，而忽视了系统性的免疫抑制因素。值得注意的是，PD-L1还在肿瘤细胞衍生的外泌体表面表达，它随外泌体循环至全身，从而结合并耗竭循环中的T细胞，产生全身性免疫抑制全身，因此，对于免疫检查点治疗，循环外泌体PD-L1的调节与肿瘤细胞PD-L1的调节一样重要。但是目前的PD-L1阻断抗体对外泌体PD-L1无效，原因之一是外泌体上PD-L1的独特表达方式使其对抗体的反应性降低。另一个原因是，外泌体可以循环至一些能屏蔽抗体作用的部位。迄今为止，在临床实践中还没有一种可以直接靶向外泌体PD-L1的药物，因此对精确调控外泌体PD-L1提出了挑战。而直接抑制肿瘤细胞外泌体的产生为降低总外泌体PD-L1提供了另一种策略。但是，考虑到正常细胞分泌的外泌体对维持正常生理至关重要，如何选择性地抑制肿瘤特异性外泌体从而降低潜在的全身毒性是另外一个亟待解决的难题。
技术实现思路
为了克服上述技术问题，本专利技术提供一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂及其制备方法与应用。本专利技术通过提取荷瘤小鼠的肿瘤组织，并处理加工形成肿瘤细胞膜囊泡，经化学修饰后形成可在肿瘤组织中原位形成凝胶的凝胶因子，在共载CDK5抑制剂和外泌体抑制剂后，可以有效的调控肿瘤细胞和肿瘤外泌体PD-L1，从而同时解除局部和系统性免疫抑制，因此具有良好的实际应用之价值。为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一个方面，提供CDK5抑制剂联合外泌体抑制药物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述CDK5抑制剂可以选自siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物和肽段；优选地，所述CDK5抑制剂选自：Roscovitine(Rosco)，奥罗莫星(olomoucine)及其衍生物，Dinaciclib(MK-7965，SCH727965)，AT7519，CIP，p5和Cpd1等；更优选地，所述CDK5抑制剂为Roscovitine；所述外泌体抑制药物包括但不限于钙离子离子通道抑制剂类、质子泵抑制剂类、鞘磷脂-核糖核酸酶抑制剂类、内皮素受体A干扰类药物；优选地，所述外泌体抑制药物可以选自：二甲基阿米洛利(DMA)、奥美拉唑、磺胺异恶唑、鞘磷脂酶抑制剂GW4869等；更优选地，所述外泌体抑制药物为二甲基阿米洛利；进一步地，所述CDK5抑制剂为Roscovitine，外泌体抑制药物为二甲基阿米洛利，二者质量比为1～10：1；优选地，二者质量比为5：1。所述抗肿瘤药物至少具有如下一种或多种用途：1)缓解肿瘤外泌体带来的免疫抑制；2)缓解肿瘤细胞表面PD-L1带来的免疫抑制；3)提高抗肿瘤效力；其中，用途1)和2)均与PD-L1相关。本专利技术的第二个方面，提供一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂，所述的基于细胞膜的生物活性制剂的药物活性成分包含上述CDK5抑制剂和外泌体抑制药物。进一步地，所述生物活性制剂为水凝胶。本专利技术的第三个方面，提供上述基于肿瘤细胞膜的水凝胶的制备方法，包括：海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜囊泡形成凝胶因子，将CDK5抑制剂和外泌体抑制药物分别溶解后混合均匀，加入凝胶因子的水溶液中搅拌处理，即得成胶溶液。本专利技术的第四个方面，提供上述基于细胞膜的生物活性制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：(1)本专利技术将CDK5抑制剂和外泌体抑制剂联合应用于抗肿瘤，同时缓解肿瘤外泌体和肿瘤细胞表面PD-L1带来的免疫抑制，具有更优异的抗肿瘤效果；(2)本专利技术首次制备了一种海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜囊泡，该结构具有凝胶因子功能，能在钙离子存在下快速形成凝胶；(3)本专利技术首次合成了一种基于细胞膜的凝胶因子，其结构区别于目前已有的凝胶因子，具有较高的生物活性；(4)本专利技术制备得到的基于细胞膜的水凝胶对正常细胞显示较好的生物相容性，毒副作用小，为设计更加安全的局部给药载体提供可能；(5)本专利技术基于细胞膜的生物活性制剂利用免疫治疗，抑制了肿瘤外泌体的产生，下调了肿瘤细胞PD-L1基因表达，提高了体内抗肿瘤效果，具有良好的实际应用之价值。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为本专利技术实施例2海藻酸钠氧化物修饰前后肿瘤细胞膜囊泡纳米结构的透射电镜图片；图2为本专利技术实施例4的O-TMV凝胶的成胶照片；图3为本专利技术实施例4的O-TMV和O-TMV@DR凝胶的扫描电镜图片；图4为本专利技术实施例5的O-TMV@水凝胶的体外细胞毒性实验表征图；图5为本专利技术实施例6的O-TMV@DR水凝胶体内抗肿瘤活性实验表征图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。如前所述，同时调控肿瘤细胞及其外泌体PD-L1数量对于提高基于PD-L1的免疫治疗十分重要。有鉴于此，专利技术人研究发现，CDK5在多种肿瘤细胞中高度活跃，研究表明，通过抑制CDK5，可以有效下调PD-L1。与标准的PD-L1阻断抗体相比，CDK5抑制剂可以发挥更彻底的作用。同时，DMA作为一种外泌体抑制剂可以有效抑制肿瘤细胞分泌外泌体的数量。因此，本专利技术通过联用外泌体抑制剂(DMA)和CDK5抑制剂Roscovitine(ROSCO)，一方面，通过DMA抑制肿瘤细胞产生外泌体，从而减少外泌体PD-L1的数量；另一方面，通过Rosco下调PD-L1，缓解IFN-γ相关的免疫耐药，二者结合，同时调控了肿瘤和外泌体的PD-L1表达。同时，利用基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CDK5抑制剂联合外泌体抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.CDK5抑制剂联合外泌体抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。


2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述CDK5抑制剂选自siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物和肽段；
优选地，所述CDK5抑制剂选自：Roscovitine，奥罗莫星及其衍生物，Dinaciclib，AT7519，CIP，p5和Cpd1；
更优选地，所述CDK5抑制剂为Roscovitine；
所述外泌体抑制药物包括钙离子离子通道抑制剂类、质子泵抑制剂类、鞘磷脂-核糖核酸酶抑制剂类、内皮素受体A干扰类药物；
优选地，所述外泌体抑制药物可以选自：二甲基阿米洛利(DMA)、奥美拉唑、磺胺异恶唑、鞘磷脂酶抑制剂GW4869等；
更优选地，所述外泌体抑制药物为二甲基阿米洛利；
进一步地，所述CDK5抑制剂为Roscovitine，所述外泌体抑制药物为二甲基阿米洛利，二者质量比为1～10：1；优选地，二者质量比为5：1。


3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物至少具有如下一种或多种用途：
1)缓解肿瘤外泌体带来的免疫抑制；
2)缓解肿瘤细胞表面PD-L1带来的免疫抑制；
3)提高抗肿瘤效力；
其中，用途1)和2)均与PD-L1相关。


4.一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂，其特征在于，所述的基于细胞膜的生物活性制剂的药物活性成分包含CDK5抑制剂和外泌体抑制药物；
优选地，所述生物活性制剂为水凝胶；
优选地，所述生物活性制剂由CDK5抑制剂、外泌体抑制药物和肿瘤细胞膜囊泡制成；更优选地，所述肿瘤细胞膜囊泡为海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜囊泡；
优选地，所述肿瘤细胞膜囊泡尺寸为150～220nm；
优选地，所述CDK5抑制剂为Roscovitine，外泌体抑制药物为二甲基阿米洛利；优选地，所述Roscovitine与二甲基阿米洛利的质量比为1～10：1；更优选地，两者质量比为5:1。


5.一种如权利要求4所述的基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂的制备方法，其特征在于，制备方法包括：
海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜囊泡形成凝胶因子，将CDK5抑制剂和外泌体抑制药物分别溶解后混合均匀形成药物溶液，加入凝胶因子的水溶液中搅拌处理，即得成胶溶液；
优选地，将CDK5抑制剂和外泌体抑制剂溶解的溶剂为去离子水；加入药物溶液的方法为滴加。


6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，肿瘤细胞膜囊泡由以下方法制备得到：
(1)收集小鼠肿瘤组织，采用匀浆法得到肿瘤单细胞悬液；
(2)探头超声得到破碎的肿瘤细胞，采用超滤离心方式进行除杂，后采用梯度离心法提取肿瘤细胞膜；

【专利技术属性】
技术研发人员：栾玉霞，李倩，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37