【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】pMHC占有率的链霉亲和素-寡核苷酸缀合物的组成相关申请本申请要求于2018年12月18日提交的美国临时专利申请62/781,377的权益和优先权，所述美国临时专利申请的内容通过引用结合在此。
技术介绍
最近已经开发出了条形码抗体和条形码pMHC多聚体，使得同源细胞和结合蛋白/肽1-4的高通量测序成为可能。条形码MHC多聚体可实现具有将此信息与转录组学、蛋白质组学和TCR序列数据相结合的能力的基于高通量多重NGS的TCR-pMHC结合事件筛选，可能在单细胞水平上进行。最近的实例证明了条形码pMHC多聚体1,4,5的可行性和实用性。然而，一个限制是当前的技术不能微调每链霉亲和素的pMHC单体载量来测量TCR-pMHC亲和力。需要能够评估TCR-pMHC亲和力的条形码pMHC多聚体。还需要成本有效的方法来制备条形码pMHC多聚体，该条形码pMHC多聚体避免化学缀合并节省MHC单体试剂。
技术实现思路
本文提供了产生共价和非共价缀合的条形码SA-寡核苷酸缀合物的组合物和方法(图1)可用作将T细胞组学分析与TCR-pMHC亲和力评估并行结合的平台。一方面，本专利技术提供了不同主链(例如，链霉亲和素)占有率的条形码pMHC多聚体种类，其由至少一种非共价结合至链霉亲和素分子的生物素化pMHC分子和至少一种共价或非共价结合到相同主链分子的核酸分子组成，其中核酸可以包含中央条形码区。另一方面，本专利技术提供了使用HPLC纯化将链霉亲和素与生物素化的寡核苷酸进行条形码编码以获得所期望的链霉亲和素占有率。另...
【技术保护点】
1.一种肽-主要组织相容性复合物(pMHC)条形码多聚体，包括：/n至少一种可调谐的pMHC实体，其中所述pMHC实体包括：/n至少一种pMHC分子，所述至少一种pMHC分子由主链分子连接；以及/n每主链分子至少一种核酸分子，/n其中所述核酸分子包括共价或非共价连接的缀合物。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181218 US 62/7813771.一种肽-主要组织相容性复合物(pMHC)条形码多聚体，包括：
至少一种可调谐的pMHC实体，其中所述pMHC实体包括：
至少一种pMHC分子，所述至少一种pMHC分子由主链分子连接；以及
每主链分子至少一种核酸分子，
其中所述核酸分子包括共价或非共价连接的缀合物。
2.根据权利要求1所述的pMHC多聚体，其中所述核酸分子包括：
pMHC条形码核苷酸的中央拉伸，以及
核苷酸的第二拉伸，所述核苷酸的第二拉伸与靶寡核苷酸互补。
3.根据权利要求2所述的pMHC多聚体，用于NGS中。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的pMHC多聚体，其中所述主链分子是链霉亲和素。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的pMHC多聚体，其中所述多聚体每主链分子包括至少一种pMHC实体、至少两种pMHC实体、至少三种pMHC实体或至少四种pMHC实体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的pMHC多聚体，用于监测T细胞受体(TCR)-pMHC亲和力。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的pMHC多聚体，其中所述链霉亲和素与所述至少一种核酸分子共价缀合，由此每链霉亲和素提供至少四种MHC单体。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的pMHC多聚体，其中所述链霉亲和素与所述至少一种核酸分子非共价缀合，其中所述核酸分子是生物素化的，并且所述至少一种生物素化的核酸分子和链霉亲和素以一定比率复合，其中所述比率选自由以下项组成的组：
1链霉亲和素:1寡核苷酸，
1链霉亲和素:2寡核苷酸，以及
1链霉亲和素:3寡核苷酸。
9.根据权利要求1所述的pMHC多聚体，所述pMHC多聚体通过HPLC纯化工艺制备。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的pMHC多聚体，其中所述链霉亲和素与所述至少一种核酸分子共价缀合，其中所述核酸分子包括条形码和至少一种生物素结合位点，其中所述结合位点包括：
生物素化的肽、生物素化的蛋白质、生物素化的聚合物、生物素化的荧光团、生物素化的可裂解寡核苷酸或生物素化的试剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的pMHC多聚体，其中所述至少一种核酸分子包括至少10个连续腺嘌呤的5’PCR柄区、中央条形码区、任选的UMI，或任选的3’聚-A尾区。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的pMHC多聚体，其中所述核酸3’端尾中的至少一种由与靶寡核苷酸序列互补的任何序列组成。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的pMHC多聚体，其中所述至少一种核酸分子的长度为约10至200个核苷酸或更长。
14.一种组合物，包括根据权利要求1至13中任一项所述的pMHC多聚体的多个子集，其中pMHC多聚体的每个子集结合不同的肽并具有对应的条形码区序列。
15.一种将特定MHC分子与对应的T细胞转录组连接的方法，包括：
a)形成测试样品，所述测试样品包括多个根据权利要求1到13中任一项所述的pMHC多聚体分子、T细胞，和颗粒，所述颗粒与结合靶寡核苷酸连接，所述结合靶寡核苷酸包括5’PCR柄、中央细胞条形码、UMI和诱饵序列；
b)由所述测试样品形成液滴，使得每个液滴包含不多于一个的颗粒，并且一个T细胞与一个或多个pMHC多聚体分子结合；
c)在每个液滴中生成T细胞cDNA文库和pMHC条形码文库；并且
d)对所述T细胞mRNA文库和所述MCH条形码文库两者进行测序，由此将特定的MHC分子与所述对应的T细胞转录组连接。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述诱饵序列是3’聚-(dT)。
17.一种多聚体pMHC，包括：
一个或多个pMHC分子，所述一个或多个pMHC分子由主链分子连接；以及
至少一种核酸分子，所述至少一种核酸分子连接至所述主链，其中所述核酸分子包括被设计用于扩增的核酸(条形码区)的中央拉伸、以及核苷酸序列，所述核苷酸序列与TCR恒定基因互补。
18.根据权利要求17所述的多聚体pMHC，包括第一类型的核酸分子，所述第一类型的核酸分子连接至所述主链；并且其中所述第一类型的核酸分子包括中央条形码区和与TCRα或TCRβ恒定基因互补的核苷酸序列。
19.根据权利要求17所述的多聚体pMHC，包括连接至所述主链的第一和第二类型的核酸分子；并且其中：
所述第一类型的核酸分子包括中央条形码区和与TCRα恒定基因互补的核苷酸序列，并且
所述第二类型的核酸分子包括中央条形码区和与TCRβ恒定基因互补的核苷酸序列；并且
所述两种类型的所述核酸分子的所述条形码区具有相同的序列；并且
任选地，用于所述两种类型的核酸分子中的每一种的UMI序列将是随机的，并且因此彼此不同，尽管它们将位于相应核酸的相同区域。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的多聚体pMHC，其中所述核酸分子包括5’PCR柄、中央条形码区、UMI和与TCR恒定基因互补的3’核苷酸序列。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的多聚体pMHC，其中所述核酸分子包括与所述TCR恒定基因的5’端互补的核苷酸序列。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的多聚体MHC，其中所述TCR恒定基因是TCRα恒定基因、TCRβ恒定1基因或TCRβ恒定2基因。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的多聚体MHC，其中所述5’端核酸分子和/或3’端核酸分子与所述主链分子连接。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的多聚体MHC，其中所述核酸分子进一步包括邻近于所述条形码区的唯一分子标识符(UMI)。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的多聚体MHC，其中至少一种核酸分子的长度为约10至200个核苷酸或更长。
26.一种组合物，包括根据权利要求17至25中任一项所述的多聚体pMHC的多个子集，其中多聚体MHC的每个子集结合不同的肽并具有对应的条形码区序列。
27.一种将特定MHC分子连接至对应的TCRα序列和/或TCRβ序列的方法，包括：
a)提供根据权利要求17至25中任一项所述的一种或多种多聚体pMHC；
b)将所述多聚体pMHC分子与T细胞接触；
c)将与所述多聚体MHC分子结合的T细胞和未与所述多聚体MHC分子结合的那些T细胞分离；
d)裂解所述已分离的T细胞；
e)生成DNA文库，其中每个DNA分子包括TCRα和/或TCRβ基因的序列以及pMHC条形码；并且
f)对所述DNA文库进行测序，由此将所述特定pMHC分子与所述对应的TCRα序列和/或TCRβ序列连接。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述步骤c)通过FACS分选或基于磁珠的分离来完成。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述多聚体pMHC分子被直接或间接荧光标记。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中结合有条形码的pMHC分子的T细胞在单个收集管中被大量分选。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中结合有条形码的pMHC分子的同源T细胞被分选至单独的板孔作为单个细胞。
32.一种多聚体pMHC，包括：
一个或多个pMHC分子，所述一个或多个pMHC分子由主链分子连接；以及
至少一种核酸分子，所述至少一种核酸分子连接至所述主链，其中所述核酸分子包括被设计用于扩增的核酸(条形码区)的中央拉伸以及模板切换寡核苷酸序列。
33.根据权利要求32所述的多聚体pMHC，其中所述核酸分子包括5’PCR柄、中央条形码区、UMI和3’模板切换寡核...
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