肽交换系统和方法技术方案

本公开内容中公开的方法允许肽定量交换至MHC蛋白。这些方法允许具有交换的肽的MHC蛋白用于其它应用，例如细胞染色。所述方法还可用于定量在复杂的混合物中存在的肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肽交换系统和方法相关申请的引用本申请要求2016年5月13日提交的美国临时申请号62/336,189和2016年11月15日提交的美国临时申请号62/422,409的权益。这些申请各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。专利技术背景在免疫应答期间，抗原呈递细胞通过MHCI类和II类分子与抗原特异性T细胞受体的相互作用激活T淋巴细胞，其进而触发CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖。通过分别使用MHCII类和I类四聚体，可能检测这些抗原特异性CD4+和CD8+T细胞，如Altman等的美国专利号5,635,363中所述，其通过引用以其整体结合到本文中。MHCI类四聚体通过四个生物素化的MHC-肽单体与荧光染料-缀合的链霉亲和素的结合形成。T细胞受体识别四聚体的能力依赖于MHC等位基因和肽序列二者。对特定的抗原/等位基因组合具有特异性的CD8+T淋巴细胞的百分数可通过在免疫荧光多色测定中用荧光MHCI类四聚体染色白细胞，接着流式细胞术分析来测定。MHCI类单体包含MHC重链、β2微球蛋白和抗原肽。对于大多数MHCI类分子而言，MHC-肽复合物的成功体外折叠依赖于肽与重链的结合，并要求肽以通常在纳摩尔范围的亲和力结合至重链。得到的四聚体是稳定的实体，其中肽与MHC蛋白紧密结合。需要产生包含这样的肽的MHCI类分子，所述肽可在折叠过程中较不紧密地结合重链，使得它们可容易地被目标肽或MHC结合分子替换，而不影响MHC复合物的完整性。肽被小分子交换或置换允许产生MHC-衍生的试剂，其可用于研究不同的抗原特异性CD8+T细胞群。一些技术已知用于在MHC蛋白中的肽交换，例如描述于Springer等,美国专利公开号2014/0370524，其内容通过引用以其整体结合到本文中。然而，需要用于定量肽交换的技术。例如，对于用于流式细胞术染色的四聚体，这是需要的。专利技术简述在一个方面，本公开内容提供了对MHC蛋白进行肽交换(例如定量肽交换)的方法。MHC蛋白可以是I类或II类分子，和它们可在任何多聚体状态(例如单体、四聚体、八聚体或十二聚体)下被交换。在另一个方面，本公开内容提供了具有高的肽交换能力的MHCI类四聚体，和用于产生它们的方法。在另一个方面，本公开内容提供了含交换的肽的MHCI类四聚体。在另一个方面，本公开内容提供了用于进行本文公开的方法的组合物和试剂盒。附图简述图1A-1F说明用于进行本文所述的方法的示例性方案。图1A显示单个珠的选择以及双珠和更大团块的排除。图IB显示基于未使用的珠设置PMT电压和收获，以具有在第一个log十进位(约0.2-0.3)中的平均荧光强度(MFI)。图1C显示对FL1通道的补偿，以消除在FITC通道中的荧光染料干扰。图ID显示对0%标记的肽(即100%肽交换)的校准水平。图IE显示对100%标记的肽(即0%肽交换)的校准水平。图IF显示对于样品交换的示例性数据。图2A是示例性的肽交换的示意图。图2B显示通过肽交换获得的四聚体使细胞染色，正如用Mart-1肽初始制备的四聚体一样。图3A和3B是本文所述的夹心免疫测定的示意图。图4显示在通过流式细胞术测量的抗-DNP信号和实际退出的DNP-标记的肽水平之间的线性相关。图5显示在通过流式细胞术测量的抗-DNP信号和实际捕获的DNP抗原之间的线性相关。图6显示用退出肽MTYK(DNP)FPVT和YTVK(DNP)FALV以及各种进入肽的肽交换结果。图7显示用退出肽ILKEKK(DNP)VHGV和ILKEK(DNP)VHGV以及各种浓度的进入肽YLLEFTPPV的肽交换实验的结果。图8为对于各种肽测量的肽交换率与它们的预测的亲和力的图示。图9为对于各种肽预测的亲和力与它们的测量的肽交换率的图示。图10A-J显示对于复合物HLA-A*24:02/QYDPVAALF而言，天然和交换的四聚体用于染色表达T细胞受体的昆虫细胞的反应性。图11显示对MHCII类等位基因HLA-DR4的肽交换结果。图12A-12E显示在复杂的混合物(疫苗)中肽交换的结果和将所述结果与基于细胞的T2移位测定和基于动物的IFN-γELISPOT测定进行比较。专利技术详述在一些方面，本公开内容提供了对MHC分子进行肽交换的方法，包括：提供与第一种肽结合的MHC分子；和使与第一种肽结合的MHC分子与第二种结合配偶体(任选地与第三种结合配偶体组合，任选地在肽交换因子存在的情况下)接触，其中接触步骤产生与第二种结合配偶体和任选地第三种结合配偶体结合的MHC分子。在一些实施方案中，肽交换对一定数量的MHC分子进行。根据这些实施方案，所述方法包括：提供第一数量的与第一种肽结合的MHC分子；和向与第一种肽结合的MHC分子添加，任选地肽交换因子，和第二数量的第二种结合配偶体(任选地与第三种结合配偶体组合)，从而形成得到的混合物，其包含与第一种肽结合的MHC分子或与第二种结合配偶体和任选地第三种结合配偶体结合的MHC分子，和未结合的第一种肽或未结合的第二种结合配偶体和任选地第三种结合配偶体。在一些实施方案中，第二种结合配偶体是肽。在一些实施方案中，第二种结合配偶体是MHC蛋白的非肽配体。例如，如美国专利公开号US2008/0044405中所述，某些含贵金属离子的化合物可与II类MHC蛋白形成复合物，和干扰它们的肽-结合能力。在一些实施方案中，提供第二种和第三种结合配偶体。根据这些实施方案，第二种和第三种结合配偶体一起与MHC结合。例如，阿巴卡韦被认为结合MHC等位基因HLA-B*57:01，这改变了结合沟，使得与未结合阿巴卡韦的HLA-B*57:01相比，结合阿巴卡韦的HLA-B*57:01可结合不同的肽。在一些方面，本公开内容提供了对MHC分子进行肽交换的方法，包括：提供与第一种肽结合的MHC分子；和使与第一种肽结合的MHC分子与第二种肽接触(任选地在肽交换因子存在的情况下)，其中接触步骤产生与第二种肽结合的MHC分子。在一些实施方案中，肽交换对一定数量的MHC分子进行。根据这些实施方案，所述方法包括：提供第一数量的与第一种肽结合的MHC分子；和向与第一种肽结合的MHC分子添加，任选地肽交换因子，和第二数量的第二种肽，从而形成得到的混合物，其包含与第一种肽结合的MHC分子或与第二种肽结合的MHC分子，和未结合的第一种肽或未结合的第二种肽。在上文的一些实施方案中，MHC分子是MHCI类分子。在一些实施方案中，MHC分子是MHCII类分子。在一些方面，本公开内容提供了对MHCI类分子进行肽交换的方法，包括：提供与第一种(即，退出)肽结合的MHCI类分子；和使与第一种肽结合的MHCI类分子与第二种(即，进入)肽接触(任选地在肽交换因子存在的情况下)，其中接触步骤产生与第二种肽结合的MHCI类分子。在一些实施方案中，肽交换对一定数量的MHCI类分子进行。根据这些实施方案，所述方法包括：提供第一数量的与第一种肽结合的MHCI类分子；和向与第一种肽结合的MHCI类分子添加，任选地肽交换因子，和第二数量的第二种肽，从而形成得到的混合物，其包含与第一种肽结合的MHCI类分子或与第二种肽结合的MHCI类分子，和未结合的第一种肽或未结合的第二种肽。在一些方面，本公开内容提供了对MHCII类分子进行肽交换的方法，包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种对MHC分子进行肽交换的方法，包括：提供与第一种肽结合的MHC分子；和使与第一种肽结合的MHC分子与第二种结合配偶体接触，其中所述接触步骤产生与第二种肽结合的MHC分子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.13 US 62/336189;2016.11.15 US 62/4224091.一种对MHC分子进行肽交换的方法，包括：提供与第一种肽结合的MHC分子；和使与第一种肽结合的MHC分子与第二种结合配偶体接触，其中所述接触步骤产生与第二种肽结合的MHC分子。2.权利要求1的方法，其中所述接触步骤在肽交换因子存在的情况下发生。3.权利要求1的方法，其中所述接触步骤在肽交换因子不存在的情况下发生。4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二种结合配偶体是第二种肽。5.前述权利要求中任一项的方法，包括：提供与第一种肽结合的MHC分子；和使与第一种肽结合的MHC分子与第二种肽接触，其中所述接触步骤产生与第二种肽结合的MHC分子。6.前述权利要求中任一项的方法，其中MHC分子是MHCI类分子。7.前述权利要求中任一项的方法，其中MHC分子是MHCII类分子。8.根据任何一个前述权利要求的对MHCI类分子进行肽交换的方法，包括：提供与第一种肽结合的MHCI类分子；和在肽交换因子存在的情况下使与第一种肽结合的MHCI类分子与第二种肽接触，其中所述接触步骤产生与第二种肽结合的MHCI类分子。9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一种肽用第一种标记物标记。10.权利要求9的方法，其中第一种标记物是生物素、半抗原或标签。11.权利要求10的方法，其中第一种标记物是第一种标签。12.权利要求11的方法，其中第一种标签是DNP。13.前述权利要求中任一项的方法，其中第二种肽不被标记。14.前述权利要求中任一项的方法，其中第二种肽不展示标签。15.权利要求1-12中任一项的方法，其中第二种肽展示第二种标记物，和另外其中第一种标记物不同于第二种标记物。16.权利要求15的方法，其中第二种标记物是生物素、半抗原或标签。17.权利要求16的方法，其中第二种标记物是第二种标签，和另外其中第一种标签不同于第二种标签。18.根据任何一个前述权利要求的对MHC分子进行肽交换的方法，包括：提供第一数量的与第一种肽结合的MHC分子；和向与第一种肽结合的MHC分子添加第二数量的第二种结合配偶体，从而形成包含与第一种肽结合的MHC分子、与第二种结合配偶体结合的MHC分子、未结合的第一种肽和未结合的第二种结合配偶体的混合物。19.权利要求18的方法，其中添加步骤进一步包括添加肽交换因子。20.权利要求1的方法，其中添加步骤不包括添加肽交换因子。21.前述权利要求中任一项的方法，其中第二种结合配偶体是第二种肽。22.根据任何一个前述权利要求的对MHC分子进行肽交换的方法，包括：提供第一数量的与第一种肽结合的MHC分子；和向与第一种肽结合的MHC分子添加肽交换因子和第二数量的第二种肽，从而形成包含与第一种肽结合的MHC分子、与第二种肽结合的MHC分子、未结合的第一种肽和未结合的第二种肽的混合物。23.前述权利要求中任一项的方法，其中MHC分子是MHCI类分子。24.前述权利要求中任一项的方法，其中MHC分子是MHCII类分子。25.前述权利要求中任一项的进行肽交换的方法，包括：提供第一数量的与第一种肽结合的MHCI类分子；和向与第一种肽结合的MHCI类分子添加肽交换因子和第二数量的第二种肽，从而形成包含与第一种肽结合的MHCI类分子、与第二种肽结合的MHCI类分子、未结合的第一种肽和未结合的第二种肽的混合物。26.前述权利要求中任一项的方法，其中第一种肽用第一种标记物标记。27.权利要求26的方法，其中第一种标记物是生物素、半抗原或标签。28.权利要求27的方法，其中第一种标记物是第一种标签。29.权利要求28的方法，其中第一种标签是DNP。30.前述权利要求中任一项的方法，其中第二种肽不被标记。31.前述权利要求中任一项的方法，其中第二种肽不展示标签。32.权利要求1-29中任一项的方法，其中第二种肽展示第二种标记物，和另外其中第一种标记物不同于第二种标记物。33.权利要求32的方法，其中第二种标记物选自生物素、半抗原或标签。34.权利要求33的方法，其中第二种标记物是第二种标签，和另外其中第一种标签不同于第二种标签。35.权利要求18-34中任一项的方法，进一步包括测定以下至少一项：与第一种肽结合的MHC分子的量、与第二种肽结合的MHC分子的量、未结合的第一种肽的量或未结合的第二种肽的量。36.权利要求18-35中任一项的方法，包括测定与第一种肽结合的MHCI类分子的量和与第二种肽结合的MHCI类分子的量的比率。37.权利要求18-36中任一项的方法，进一步包括测定未结合的第一种肽的量，和比较未结合的第一种肽的量和与第一种肽结合的MHC分子的第一数量。38.权利要求18-37中任一项的方法，进一步包括测定未结合的第一种肽的量，和比较未结合的第一种肽的量和与第一种肽结合的MHCI类分子的第一数量。39.权利要求35-38中任一项的方法，其中测定步骤包括进行免疫测定。40.权利要求39的方法，其中测定步骤通过进行免疫测定完成。41.权利要求40的方法，其中免疫测定是夹心免疫测定。42.权利要求41-42中任一项的方法，其中进行夹心免疫测定包括：提供与第一种抗体缀合的支持物；将第一种抗体结合至与第一种肽结合的MHC分子和与第二种肽结合的MHC分子；提供能够结合第一种肽的第二种抗体；将第二种抗体结合至与第一种肽结合的MHC分子，从而第二种抗体结合至支持物；测定结合至支持物的第二种抗体的量。43.权利要求42的方法，其中所述支持物包括磁性珠或无磁性珠。44.权利要求41-43中任一项的方法，其中进行夹心免疫测定包括使用磁铁、通过离心或通过抽吸，使珠沉淀。45.权利要求42-44中任一项的方法，其中第一种抗体是抗-MHC或抗-链霉亲和素抗体。46.权利要求42-45中任一项的方法，其中第一种肽用DNP标记和第二种抗体是抗-DNP抗体。47.权利要求42-46中任一项的方法，其中第二种抗体用荧光团或放射性标记物标记。48.权利要求42-47中任一项的方法，其中第二种抗体用荧光团标记。49.前述权利要求中任一项的方法，进一步包括进行对照肽交换。50.权利要求18-49中任一项的方法，其中所述混合物进一步包含另外的肽、脂质或多核苷酸。51.用于肽交换的试剂盒，包括与第一种肽结合的MHC分子。52.权利要求51的用于肽交换的试剂盒，进一步包括肽交换因子。53.权利要求51-52中任一项的试剂盒，其中第一种肽用第一种标记物标记。54.权利要求51-53中任一项的试剂盒，其中第一种标记物是生物素、半抗原或标签。55.权利要求51-54中任一项的试剂盒，其中第一种标记物是第一种标签。56.权利要求51-55中任一项的试剂盒，其中第一种标签是DNP。57.权利要求55-56中任一项的试剂盒，进一步包括抗-第一种标签抗体。58.权利要求51-57中任一项的试剂盒，进一步包括包含抗-MHC蛋白抗体的捕获系统。59.权利要求51-58中任一项的试剂盒，其中捕获系统包括磁性捕获珠。60.权利要求51-59中任一项的试剂盒，包括：与第一种肽结合的MHCI类分子；和肽交换因子。61.权利要求51-60中任一项的试剂盒，其中第一种肽展示第一种标签，和进一步包括：抗-第一种标签抗体；和包含抗-MHC蛋白抗体的捕获系统。62.权利要求51-61中任一项的试剂盒，进一步包括参考肽。63.前述权利要求中任一项的方法或试剂盒，其中MHC分子是MHCI类分子的单体。64.前述权利要求中任一项的方法或试剂盒，其中MHC分子是MHCI类多聚体的组分。65.权利要求64的方法或试剂盒，其中所述多聚体包含4个MHCI类分子。66.权利要求65的方法或试...

【专利技术属性】
技术研发人员：M德尔科门内，
申请(专利权)人：MBL国际公司，
类型：发明
国别省市：美国,US