用于控制昆虫有害生物的组合物和方法技术

披露了用于控制植物有害生物的组合物和方法。特别地，提供了对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫有害生物具有毒性的新颖杀昆虫蛋白。还提供了编码所述新颖杀昆虫蛋白的核酸分子。还披露了制备所述杀昆虫蛋白的方法，和使用所述杀昆虫蛋白以及编码本发明专利技术的杀昆虫蛋白的核酸的方法，例如，在转基因植物中赋予免于昆虫损害的保护。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于控制昆虫有害生物的组合物和方法序列表序列表的官方副本是以ASCII格式的序列表以2019年1月10日生成的名为“81291-US-L-ORG-P-1_SeqList_ST25.txt”的文件进行电子提交的，并且该序列表的大小为22千字节并且与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式文件中的序列表是本说明书的一部分，并且通过引用以其全文并入本文。
本专利技术涉及杀有害生物蛋白和编码它们的核酸分子，连同用于控制植物有害生物的组合物和方法。
技术介绍
昆虫有害生物是引起作物损失的一个主要原因。仅在美国，由于各个属的昆虫(尤其是来自鳞翅目和鞘翅目的昆虫)的侵染每年就损失数十亿美元。除了大田作物的损失之外，昆虫有害生物对于菜农和果农、对于观赏性花卉的生产商而言也是一种负担，并且对于园丁和房屋所有者而言是一种令人讨厌的东西。传统上，昆虫有害生物是通过密集施用化学杀有害生物剂来控制，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫成长、预防昆虫摄食或繁殖、或者导致死亡而有效。生物性有害生物控制剂，例如表达杀有害生物毒素(例如δ-内毒素(也称为Cry蛋白))的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株，也已经施用于作物植物中，产生了令人满意的结果，提供化学杀有害生物剂的替代物或补充物。已经分离了编码这些Cry蛋白中的一些的基因并且它们在异源宿主(如转基因植物)中的表达已经显示出提供了另一种用于控制经济上重要的昆虫有害生物的手段。因此可以达到良好的昆虫控制，但是某些化学品有时也能影响非靶标有益昆虫，并且某些生物制剂具有非常窄的活性谱。此外，某些化学和生物控制方法的继续使用增加了昆虫有害生物对此类控制措施产生抗性的机会。通过各种抗性管理实践已部分地缓和了这种状况，但仍需要开发新的并有效的有害生物控制剂，这些有害生物控制剂为农民提供经济利益并且是环境可接受的。特别需要的是可以靶向更广谱的经济上重要的昆虫有害生物的控制剂(特别是靶向鳞翅目有害生物和鞘翅目有害生物两者的控制剂)和有效控制昆虫群体(这些昆虫群体对现有的昆虫控制剂是有抗性的或可以变得有抗性)的控制剂。
技术实现思路
鉴于这些需求，本专利技术的目的是通过提供可以用来控制多种植物有害生物(通过提供组合物和方法以赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀有害生物活性)的新颖基因和杀有害生物蛋白来提供新型有害生物控制剂。特别地，本专利技术提供了编码BT1537或BT1538杀昆虫蛋白(包括SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的氨基酸取代、缺失、插入和/或片段)的组装的多核苷酸和相关变体多核苷酸。另外，涵盖了对应于BT1537或BT1538多肽的氨基酸序列。本专利技术进一步提供了SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的组装的或分离的或重组的核酸分子，这些核酸分子能够编码BT1537或BT1538杀昆虫蛋白以及其氨基酸取代、缺失、插入、片段及其组合。还涵盖了与本专利技术的多核苷酸互补的核酸或与本专利技术的多核苷酸杂交的核酸。本专利技术进一步涉及由本专利技术的组装的多核苷酸和相关多核苷酸表达产生的BT1537或BT1538杀昆虫蛋白，并且涉及含有这些杀昆虫蛋白的组合物以及配制品，它们通过抑制昆虫有害生物的生存、生长以及繁殖的能力，或者限制昆虫相关的对作物植物的损害或损失而对昆虫有毒。本专利技术的杀昆虫蛋白包括衍生自组装的多核苷酸的蛋白以及具有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的突变型或变体杀昆虫蛋白。本专利技术的突变型杀昆虫蛋白的实例包括但不限于经突变以具有比衍生突变体的亲本BT1537或BT1538杀昆虫蛋白更宽的活性谱或更高的特异活性的那些，经突变以引入表位来产生从BT1537或BT1538亲本蛋白中差异性地识别出经突变的蛋白的抗体的那些，或经突变以调节在转基因生物中的表达的那些。本专利技术的新颖杀昆虫蛋白对昆虫有害生物是高毒性的。例如，本专利技术的BT1537或BT1538蛋白或相关蛋白可用于控制鳞翅目有害生物和鞘翅目昆虫有害生物两者。特别地，BT1537或BT1538杀昆虫蛋白可具有针对鳞翅目昆虫有害生物(包括但不限于欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)(欧洲玉米蛀虫；ECB)、小地老虎(Agrotisipsilon)(黑切根虫；BCW)、小蔗螟(Diatraeasaccharalis)(甘蔗蛀虫；SCB)、玉米穗虫(Helicoverpazea)(玉米穗蛾；CEW)、大豆尺蠖(Chrysodeixisincludens)(大豆夜蛾；SBL)、黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)(绒毛豆毛虫；VBC)和/或烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)(烟夜蛾；TBW))和鞘翅目昆虫有害生物(包括但不限于玉米根萤叶甲(Diabroticavirgiferavirgifera)(西方玉米根虫；WCR)、巴氏根萤叶甲(Diabroticabarberi)(北方玉米根虫；NCR)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabroticaundecimpunctatahowardi)(南方玉米根虫；SCR)和/或其他根萤叶甲属(Diabrotica)物种(包括墨西哥玉米根萤叶甲(Diabroticavirgiferazeae)(墨西哥玉米根虫))的活性。在本专利技术的一些方面，提供了编码BT1537或BT1538杀昆虫蛋白及其变体或突变型蛋白的合成多核苷酸，这些合成多核苷酸已经进行一个或多个密码子优化用于在转基因生物(例如转基因细菌或转基因植物)中表达。此类转基因细菌包括但不限于转基因大肠杆菌或转基因苏云金芽孢杆菌。此类转基因植物包括但不限于转基因玉米植物或转基因大豆植物。在其他方面，本专利技术进一步提供了表达盒和重组载体，其包含编码本专利技术的BT1537或BT1538杀昆虫蛋白的多核苷酸。本专利技术还提供了包含嵌合基因或表达盒或重组载体的经转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子，该嵌合基因或表达盒或重组载体在经转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子中表达本专利技术的BT1537或BT1538杀昆虫蛋白方面是有用的。在本专利技术的其他方面，提供了产生本专利技术的BT1537和/或BT1538杀昆虫蛋白的重组细菌，例如大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bt)。在其他方面，本专利技术提供了使用本专利技术的多核苷酸的方法，例如在DNA构建体或嵌合基因或表达盒或重组载体中用于在生物(包括植物和微生物，如细菌)中进行转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以是组装的、天然的或密码子优化的序列，这些序列已经被设计用于在生物(如植物或细菌)中表达，或者制备衍生自本专利技术的BT1537和/或BT1538蛋白的、具有增强的杀有害生物活性的杂合毒素。本专利技术进一步涉及制备BT1537或BT1538杀昆虫蛋白的方法以及使用这些多核苷酸序列和杀昆虫蛋白的方法，例如，在微生物中控制昆虫或者在转基因植物中赋予免受昆虫损害的保护。在本专利技术的其他方面，提供了杀昆虫组合物和配制品(包含本专利技术的BT1537或BT1538杀昆虫蛋白或本专利技术的苏云金芽孢杆菌菌株)，以及使用这些组合物或配制品来控制昆虫群体的方法，例如通过将这些组合物或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸分子，所述核酸分子包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码对鳞翅目或鞘翅目有害生物有毒的杀昆虫蛋白，其中所述核苷酸序列(a)与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2或其毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列同一性；或者(b)编码如下杀昆虫蛋白，所述杀昆虫蛋白包含与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者(c)是(a)或(b)的组装的核苷酸序列；或者(d)是(a)、(b)或(c)的合成序列，所述合成序列已经进行密码子优化用于在转基因生物中表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190110 US 62/790,6661.一种核酸分子，所述核酸分子包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码对鳞翅目或鞘翅目有害生物有毒的杀昆虫蛋白，其中所述核苷酸序列(a)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或其毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列同一性；或者(b)编码如下杀昆虫蛋白，所述杀昆虫蛋白包含与SEQIDNO:21或SEQIDNO:22或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者(c)是(a)或(b)的组装的核苷酸序列；或者(d)是(a)、(b)或(c)的合成序列，所述合成序列已经进行密码子优化用于在转基因生物中表达。


2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1-20中的任一个或其毒素编码片段。


3.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述杀昆虫蛋白包含SEQIDNO:21-38中的任一个或其毒性片段的氨基酸序列。


4.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述合成核苷酸序列包含SEQIDNO:3-20中的任一个或其毒素编码片段。


5.一种嵌合基因，所述嵌合基因包含可操作地连接至如权利要求1-4中任一项所述的核酸分子的异源启动子。


6.如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述异源启动子是植物可表达型启动子。


7.如权利要求6所述的嵌合基因，其中所述植物可表达型启动子选自由以下组成的组的启动子：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS6、玉蜀黍H3组蛋白、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、水稻肌动蛋白、水稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、大豆富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白、凝集素、CaMV35S以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。


8.如权利要求5所述的嵌合基因，其中(a)所述鳞翅目有害生物选自由以下组成的组：欧洲玉米蛀虫(欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis))、玉米穗蛾(玉米穗虫(Helicoverpazea))、黑切根虫(小地老虎(Agrotisipsilon))、大豆夜蛾(大豆尺蠖(Chrysodeixisincludens))、绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis))和烟夜蛾(烟芽夜蛾(Heliothisvirescens))；或者(b)所述鞘翅目有害生物是根萤叶甲属(Diabrotica)物种。


9.如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述转基因生物是细菌或植物。


10.一种杀昆虫蛋白和任选地一种分离的杀昆虫蛋白，其中所述蛋白或分离的蛋白包含(a)与SEQIDNO:21或SEQIDNO:22或其毒素片段的氨基酸序列具有至少80％到至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者(b)由与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或其毒素编码片段的核苷酸序列具有至少80％到至少99％序列同一性的核苷酸序列或组装的核苷酸序列编码的氨基酸序列。


11.如权利要求10所述的蛋白，其中所述氨基酸序列包含SEQIDNO:21或SEQIDNO:22或其毒素片段。


12.如权利要求10所述的蛋白，其中所述氨基酸序列由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1-20中的任一个或其毒素编码片段。


13.如权利要求10-12中任一项所述的蛋白，其中，其中(a)所述鳞翅目有害生物选自由以下组成的组：欧洲玉米蛀虫(欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis))、玉米穗蛾(玉米穗虫(Helicoverpazea))、黑切根虫(小地老虎(Agrotisipsilon))、大豆夜蛾(大豆尺蠖(Chrysodeixisincludens))、绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis))和烟夜蛾(烟芽夜蛾(Heliothisvirescens))；或者(b)所述鞘翅目有害生物是根萤叶甲属(Diabrotica)物种。


14.一种产生如权利要求10所述的蛋白的重组苏云金芽孢杆菌菌株或大肠杆菌菌株。


15.一种杀昆虫组合物，所述杀昆虫组合物包含如权利要求10所述的蛋白和农业上可接受的载体。


16.如权利要求15所述的组合物，其中所述农业上可接受的载体选自由以下组成的组：粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体以及溶液。


17.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物通过脱水、冷冻干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩苏云金芽孢杆菌菌株的培养物而制备。


18.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物包含产生所述蛋白的转基因细菌细胞。


19.如权利要求15所述的组合物，所述组合物包含按重量计从约1％至约99％的所述蛋白。


20.一种重组载体，所述重组载体包含如权利要求1所述的核酸分子或如权利要求5所述的嵌合基因。


21.一种转基因细菌细胞或植物细胞，所述转基因细菌细胞或植物细胞包含如权利要求20所述的重组载体。


22.如权利要求21所述的转基因细菌细胞，其中所述细菌细胞在芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·塞斯勒，C·弗莱明，K·赛吉恩，
申请(专利权)人：先正达农作物保护股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH