一种凤尾草抑菌成分的制备、分离及鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种凤尾草抑菌成分的制备、分离及鉴定方法，该制备方法通过合理控制料液比、温度、及时间，并选择适合的提取液，能快速有效提取凤尾草中的抑菌成分，提高后续研究的效率和可靠性。采用薄层色谱法，通过筛选出适合的展开剂，能将由凤尾草制成的抑菌液中的各成分在薄层板上展开形成斑点而获得薄层色谱图谱，容易借助显色剂或紫外光观察到分离出的斑点，并确定该抑菌液中抑菌成分含量高低，为建立抑菌成分与抑菌效果关联性的快速鉴别方法提供基础。通过抑菌圈实验及薄层色谱法建立薄层色谱图谱，可以快速鉴别凤尾草中的活性抑菌成分含量高低，从而筛选出优质的凤尾草。

【技术实现步骤摘要】
一种凤尾草抑菌成分的制备、分离及鉴定方法
本专利技术涉及凤尾草加工领域，特别是涉及一种凤尾草抑菌成分的制备、分离及鉴定方法。
技术介绍
凤尾草是凤尾蕨科凤尾蕨属植物，主要以其叶形和生态环境来命名，如金鸡尾、鸡脚草、井栏边草等，喜生长在荫蔽、湿润、温暖处，也耐旱，在南方冬季，石缝中生长的植株即使经—二月的干旱，也不会完全枯死；凤尾草以全草入药，性凉，味微苦，归肝、肾、大肠经，具有清热利湿、凉血止血、消肿解毒等功效，用于治疗痢疾、肠炎、黄疸型肝炎、吐血、便血、尿血等病症，具有明显的抑菌效果。虽然大多数不同来源的凤尾草的成分类别基本相同，但是因为产地、采摘季节等因素的差异，其抑菌成分的含量也不同，所以不同来源的凤尾草的质量不同，临床疗效也有差异。现有的凤尾草抗菌活性研究中，还没有一种关于抑菌成分与抑菌效果关联性的快速鉴别方法，不能快速的筛查出优质凤尾草。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的上述缺陷，提供了一种凤尾草抑菌成分的制备、分离及鉴定方法，通过研究不同来源凤尾草的薄层色谱图谱和抑菌圈试验，初步建立一种能够快速鉴定优质凤尾草的薄层色谱图谱，为日后合理开发凤尾草资源提供科学依据。为实现上述目的，本专利技术提供了一种凤尾草抑菌成分的制备方法，包括以下步骤：S1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，称取8～12g凤尾草粉末并与体积浓度为70％以上的乙醇按料液比为1：5～6g.mL-1的比例混合均匀后浸泡30～40min，再在45～55℃下加热回流提取0.5～1.5h，冷却后获得凤尾草混合提取液；S2.抑菌液的制备：将步骤S1中的凤尾草混合提取液过滤得滤液，将滤液蒸干后取残渣，向残渣中加20～30mL水溶散后，加入20～30mL乙酸乙酯振摇后用分液漏斗进行分离，取上清液，然后在水浴中蒸干获得料渣，将料渣用1～1.5mL无水乙醇溶解，即获得含有凤尾草抑菌成分的抑菌液，将该抑菌液在3～6℃条件下冷藏保存。作为本专利技术的进一步改进，凤尾草抑菌成分的制备方法，包括以下步骤：S1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，称取10g凤尾草粉末并与体积浓度为70％的乙醇按料液比为1∶5g.mL-1的比例混合均匀后浸泡30min，再在50℃下加热回流提取1h，冷却后获得凤尾草混合提取液；S2.抑菌液的制备：将步骤S1中的凤尾草混合提取液过滤得滤液，将滤液蒸干后取残渣，向残渣中加20mL水溶散后，加入20mL乙酸乙酯振摇后用分液漏斗进行分离，取上清液，然后在水浴中蒸干获得料渣，将料渣用1mL无水乙醇溶解，即获得含有凤尾草抑菌成分的抑菌液，将该抑菌液在4℃条件下冷藏保存。上述凤尾草抑菌成分的分离方法，包括以下步骤：(1)抑菌成分的分离：取薄层色谱薄层板，于干燥箱中在下述条件下烘烤干燥：烘烤温度为100±1℃，烘烤时间为1小时，用微量定量点样器取1±0.1μL由凤尾草制成的抑菌液并点样于薄层板上并吹干，将点样后的薄层板放入装有展开剂溶液的层析缸中，然后盖上盖子密封，开始对抑菌液进行展开分离，展开分离完毕后，取出薄层板，画出展开剂在薄层板上展开后的前沿位置并晾干，最后将晾干的薄层板置于紫外光灯下检视分离后形成的斑点，测量并计算各斑点的Rf值；(2)显色实验：向步骤(1)晾干的薄层板喷洒显色剂，然后在干燥箱中按下述条件进行烘烤干燥：烘烤温度为100～120℃，烘烤时间为3～6min，即可获得显色的斑点。作为本专利技术的进一步改进，所述展开剂为由体积比为5:1:1的正己烷、乙酸乙酯、及甲酸制成的展开系统，由体积比为13:3:1的乙酸乙酯、甲酸、及水制成的展开系统，由体积比为5:5:2的乙酸乙酯、乙醇、及水制成的展开系统，或由体积比为13:6:2的三氯甲烷、乙醇、及水制成的展开系统。作为本专利技术的进一步改进，所述展开剂为由体积比为正己烷、乙酸乙酯、及甲酸制成的展开系统。作为本专利技术的进一步改进，所述显色剂为碘化铋钾溶液、浓度为0.05g.mL-1的香草醛硫酸溶液、或浓度为0.1g.mL-1的磷钼酸乙醇溶液。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(2)中烘烤温度为100℃，烘烤时间为5min。作为本专利技术的进一步改进，所述紫外光灯中紫外光的波长为365nm。上述凤尾草抑菌成分的抑菌效果鉴定方法，包括以下步骤：a.菌液的制备：取-78～-80℃冷冻保存的大肠杆菌冻存管，将其吸入LB液体培养基中培养，于35～37℃摇床上放置6～6.5h进行快速复壮，用分光光度计测定细菌数量，备用；b.抑菌效果鉴定：吸取步骤a中复壮好的菌液99～101μL于麦康凯琼脂培养基上，用三角涂布棒将菌液均匀涂布在琼脂培养基上，采用琼脂打孔法打孔，然后吸取29～31μL的麦康凯琼脂培养基封底，往培养基的孔中分别加入凤尾草制成的抑菌液作为实验组，加入乙醇作为对照组，，静置0.5h以上，然后置于35～37℃恒温培养16～16.5h，观察并测量抑菌圈的的直径大小。作为本专利技术的进一步改进，所述凤尾草抑菌成分的抑菌效果鉴定方法，包括以下步骤：a.菌液的制备：取-80℃冷冻保存的大肠杆菌冻存管，将其吸入LB液体培养基中培养，放置于37℃摇床6h进行快速复壮，用分光光度计测定细菌数量，备用；b.抑菌效果鉴定：吸取步骤a中复壮好的菌液100μL于麦康凯琼脂培养基上，用三角涂布棒涂开，采用琼脂打孔法打孔，然后吸取30μL的麦康凯琼脂培养基封底，往培养基的孔中分别加入凤尾草制成的抑菌液作为实验组，加入乙醇作为对照组，静置0.5h，然后置于37℃恒温培养16h，观察并测量抑菌圈的的直径大小。与现有技术相比，本专利技术提供的凤尾草抑菌成分的制备方法有益效果在于：该制备方法通过合理控制料液比、温度、及时间，并选择适合的提取液，能快速有效提取凤尾草中的抑菌成分，提高后续研究的效率和可靠性。本专利技术的凤尾草抑菌成分的分离方法的有益效果在于：采用薄层色谱法，通过筛选出适合的展开剂，能将由凤尾草制成的抑菌液中的各成分在薄层板上展开形成斑点而获得薄层色谱图谱，容易借助显色剂或紫外光观察到分离出的斑点，并确定该抑菌液中的主要成分，为建立抑菌成分与抑菌效果关联性的快速鉴别方法提供基础。本专利技术的凤尾草抑菌成分的抑菌效果鉴定方法，通过抑菌圈实验并结合薄层色谱图谱及显色实验，可以快速鉴别凤尾草中的活性抑菌成分，从而筛选出优质的凤尾草。综上所述，采用薄层色谱法，按照本专利技术的凤尾草制备方法制备抑菌液，选用本专利技术的展开剂可以将凤尾草抑菌液中的抑菌成分分离，在紫外光下可观察到在薄层板上形成有清晰可辨的斑点；再对薄层板喷洒不同的显色剂，展开成分在不同显色剂中呈现不同颜色，结合抑菌圈实验结果，可以快速的鉴定优质凤尾草及其活性抑菌成分。本专利技术的上述研究不仅为提高凤尾草的质量控制水平，建立和完善相关质量标准打下基础，也为日后合理开发凤尾草资源提供科学依据。附图说明为了更清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凤尾草抑菌成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，称取8～12g凤尾草粉末并与体积浓度为70％以上的乙醇按料液比为1：5～6g.mL

【技术特征摘要】
1.一种凤尾草抑菌成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，称取8～12g凤尾草粉末并与体积浓度为70％以上的乙醇按料液比为1：5～6g.mL-1的比例混合均匀后浸泡30～40min，再在45～55℃下加热回流提取0.5～1.5h，冷却后获得凤尾草混合提取液；
S2.抑菌液的制备：将步骤S1中的凤尾草混合提取液过滤得滤液，将滤液蒸干后取残渣，向残渣中加20～30mL水溶散后，加入20～30mL乙酸乙酯振摇后用分液漏斗进行分离，取上清液，然后在水浴中蒸干获得料渣，将料渣用1～1.5mL无水乙醇溶解，即获得含有凤尾草抑菌成分的抑菌液，将该抑菌液在3～6℃条件下冷藏保存。


2.根据权利要求1所述的凤尾草抑菌成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，称取10g凤尾草粉末并与体积浓度为70％的乙醇按料液比为1：5g.mL-1的比例混合均匀后浸泡30min，再在50℃下加热回流提取1h，冷却后获得凤尾草混合提取液；
S2.抑菌液的制备：将步骤S1中的凤尾草混合提取液过滤得滤液，将滤液蒸干后取残渣，向残渣中加20mL水溶散后，加入20mL乙酸乙酯振摇后用分液漏斗进行分离，取上清液，然后在水浴中蒸干获得料渣，将料渣用1mL无水乙醇溶解，即获得含有凤尾草抑菌成分的抑菌液，将该抑菌液在4℃条件下冷藏保存。


3.权利要求1或2所述的凤尾草抑菌成分的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)抑菌成分的分离：取薄层色谱薄层板，于干燥箱中在下述条件下烘烤干燥：烘烤温度为100±1℃，烘烤时间为1小时以上，用微量定量点样器取1±0.1μL由凤尾草制成的抑菌液并点样于薄层板上并吹干，放入装有展开剂溶液的层析缸中，然后盖上盖子密封，开始对抑菌液进行展开分离，展开分离完毕后，取出薄层板，画出展开剂在薄层板上展开后的前沿位置并晾干，最后将晾干的薄层板置于紫外光灯下检视分离后形成的斑点，测量并计算各斑点的Rf值；
(2)显色实验：向步骤(1)晾干的薄层板喷洒显色剂，然后在干燥箱中按下述条件进行烘烤干燥：烘烤温度为100～120℃，烘烤时间为3～6min，即可获得显色的斑点。


4.根据权利要求3所述的凤尾草抑菌成分的分离方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小莺，鲍光明，刘宝生，刘立恒，郭小权，邓科，邹志萱，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西;36