适体选择方法技术

本公开涉及鉴定针对过敏原蛋白的适体和信号传导多核苷酸(SPN)以用于过敏原检测的方法。本公开的筛选方法联合了多个SELEX正选择以及芯片上正选择和反向选择，以鉴定当与短互补序列竞争时优选结合靶蛋白的适体序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】适体选择方法相关申请的交叉引用本申请要求在2018年8月3日提交的标题为“MethodsforAptamerSelection”的美国临时申请62/714,102的优先权；其内容通过引用以其全文并入本文。参考序列表随本申请一起提交的有电子格式的序列表文本文件。序列表以标题为2066_1011PCT_SL.txt的文件提供，该文件创建于2019年8月1日，大小为14,790,207字节。所述序列表的内容通过引用以其全文并入本文。
本公开涉及鉴定针对感兴趣的靶标(例如过敏原)的适体的方法。本公开还提供了适体、信号传导多核苷酸(SPN)、DNA芯片、检测传感器和试剂盒，以及用于检测样品中靶标的测定法(assay)。技术背景核酸适体是能够以高亲和力和高特异性与靶分子结合的单链寡核苷酸(DNA、RNA或DNA/RNA杂交体)。通常通过吸附、回收和再扩增的重复过程，例如通过常规SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，指数富集的配体系统进化技术)和其他密切相关的方法(参见例如美国专利号：5,270,163、5,567,588；5,637,459、5,670,637、5,705,337和5,723,592)，来从具有随机序列的寡核苷酸文库中选择核酸适体。适体可以采取独特的二级和三级结构，并以高亲和力和高特异性识别靶标。由于不需要在动物或细胞系中进行适体选择，故适体作为抗体的替代物性价比高，它们具有多年的货架期，并且它们可以容易地被修饰以减少与不希望的分子的交叉反应性。适体与抗体相比具有显著的优势，例如更好的特异性和亲和力、更广泛的靶标种类、更容易的合成和修饰、更高的稳定性和更低的成本。这些特性有利于使适体成为广泛用于生物传感器开发以及其他领域的新的检测剂，用于检测样品中靶分子的存在、不存在和/或数量。例如，除许多其他有用的应用(例如诊断性测试和治疗)外，适体和基于适体的测定法还显示出是食品安全控制中有前景的替代物，例如对食物中病原体、毒素、过敏原和其他禁用污染物的检测和控制(Amaya-Gonzalez等人,Sensors,2013,13:16292-16311；和Amaya-Gonzalez等人,Anal.Chem.2014,86(5),2733-2739)。基于适体的测定法替代了许多使用抗体的免疫印迹方法(例如ELISA)。过敏(例如食物过敏)是常见的医学病况。据估计，在美国有多达2％的成人和多达8％的儿童(尤其是那些三岁以下的儿童)患有食物过敏(约1500万人)，并且认为这个患病率在持续增加。无论是在临床背景下还是从消费者的角度，过敏原检测对于对某些类型的食物(例如麸质和花生)过敏的人都是重要的。针对过敏原的灵敏且特异的检测剂是开发能够在食用前高效且快速地对可疑食品进行检测的检测测定法的关键。在许多过敏原检测传感器和测定法中均采用了选择性结合过敏原的适体(Weng和Neethirajan,BiosensBioelectron,2016,85:649-656；Svobodova等人,FoodChem.,2014,165:419-423；Tran等人,Biosens.Bioelectron,2013,43,245-251；和Nadal等人,PlosOne,2012,7(4):e35253)。研究已表明，基于适体的测定法相比基于抗体的免疫测定法(例如ELISA)具有显著优势。本公开开发了鉴定针对特定过敏原靶标的适体序列的改进的选择方法；所述适体和/或衍生自适体的信号多核苷酸可以直接用于检测测定法中，具有增加的特异性和灵敏度。具体而言，所述改进的选择方法联合了多个正选择(positiveselection)、负选择(negativeselection)和反向选择(counterselection)过程，以鉴定可以特异性识别靶分子(例如，过敏原蛋白)的适体，而此类适体的特征(例如，一级结构和二级结构)阻断了与靶标结合的同一适体与包含与所述同一适体互补的序列的短寡核苷酸杂交。因此，靶标和短互补序列不同时与同一适体结合。
技术实现思路
本公开提供了为选择针对靶分子的适体而定制的筛选方法，所述适体可以直接用于基于竞争的靶标检测测定法，例如过敏原检测测定法；所述方法包括多个正、负(反向)选择过程(process)，以鉴定具有特定一级和二级结构特征的适体，从而当所述适体与靶分子结合形成适体:靶标复合物时，其不会同时与互补于适体序列的短寡核苷酸杂交。所鉴定的适体适合于开发用于靶标检测的芯片传感器，其中在与所述适体的序列互补的寡核苷酸(即锚定序列)存在下，所述适体或源自所述适体的信号多核苷酸竞争结合其靶分子。在一些实施方案中，所述筛选方法包括：(a)制备包含多个单链DNA(ssDNA)分子的输入DNA文库(inputDNAlibrary)，每个单链DNA包含一个中央随机核酸序列，两侧是5'端的恒定序列和3'端的恒定序列，所述恒定的5'端和恒定的3'端充当引物；(b)从(a)的输入DNA文库中选择基本上(substantially)与靶标物结合的ssDNA分子的池；(c)从获得自(b)的ssDNA分子靶标结合池中，选择在靶标物存在下不与互补序列杂交(即不同时与靶标和互补序列结合)的ssDNA分子的池；(d)从获得自(c)的正结合ssDNA分子池中，反向选择在靶标物不存在下不与互补序列杂交的ssDNA分子，或者基本上与反向靶标物(coutertargetmaterial)结合的ssDNA分子；和(e)从(c)中的正结合ssDNA分子池中减去获得自(d)的ssDNA分子池，并鉴定与感兴趣的靶标特异性结合的候选ssDNA分子。ssDNA分子的每个子池均可通过SELEX和/或芯片上正选择过程进行鉴定，并且每个过程可在相同条件下重复数轮。因此，通过本专利技术的筛选方法鉴定的适体和衍生自所述适体的信号传导多核苷酸(SPN)以高亲和力和高特异性与其靶分子结合。在一些实施方案中，所述适体和SPN可在靶分子存在下不与短互补序列杂交，但它们能在靶分子不存在下与短互补序列结合。在一些实施方案中，本专利技术的筛选方法进一步包括在每个选择过程之后对每个池中的ssDNA分子进行扩增。可以通过PCR并使用标记有荧光团探针的引物对对所述ssDNA分子进行扩增。由此，所扩增和再生的ssDNA分子标记有荧光团探针。在一些实施方案中，可以使用输入ssDNA文库和靶标物，通过改进的氧化石墨烯(GO)-SELEX流程来选择基本上与靶标结合的ssDNA分子池。这个正选择可以包括以下步骤：(i)使输入ssDNA文库与靶标物接触，其中在靶标和输入文库中存在的多个ssDNA分子之间形成复合物；(ii)使用氧化石墨烯(GO)溶液分隔步骤(i)中形成的复合物，并分离复合物中的ssDNA分子以产生针对靶标物的ssDNA分子的子集；(iii)使(ii)中的ssDNA分子的子集与相同的靶标物接触，其中在靶标和ssDNA分子子集中存在的第二群ssDNA分子之间形成复合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴定与感兴趣的靶标特异性结合的适体的方法，包括：/n(a)制备包含多个单链DNA(ssDNA)分子的输入DNA文库，每个单链DNA包含一个中央随机核酸序列，两侧是5'端的恒定序列和3'端的恒定序列，所述恒定的5'端和恒定的3'端充当引物；/n(b)从(a)的输入DNA文库中选择基本上与所述靶标结合的ssDNA分子的池；/n(c)从获得自(b)的ssDNA分子靶标结合池中，选择在靶标存在下基本上不与其互补序列杂交的ssDNA分子的池；/n(d)从获得自(c)的ssDNA分子正结合池中反向选择在靶标不存在下不与互补序列杂交的ssDNA分子，以及基本上与反向靶标结合的序列；和/n(e)从(c)中的的ssDNA分子正结合池中减去获得自(d)的ssDNA分子，并鉴定与所述感兴趣的靶标特异性结合的ssDNA分子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180803 US 62/714,1021.一种用于鉴定与感兴趣的靶标特异性结合的适体的方法，包括：
(a)制备包含多个单链DNA(ssDNA)分子的输入DNA文库，每个单链DNA包含一个中央随机核酸序列，两侧是5'端的恒定序列和3'端的恒定序列，所述恒定的5'端和恒定的3'端充当引物；
(b)从(a)的输入DNA文库中选择基本上与所述靶标结合的ssDNA分子的池；
(c)从获得自(b)的ssDNA分子靶标结合池中，选择在靶标存在下基本上不与其互补序列杂交的ssDNA分子的池；
(d)从获得自(c)的ssDNA分子正结合池中反向选择在靶标不存在下不与互补序列杂交的ssDNA分子，以及基本上与反向靶标结合的序列；和
(e)从(c)中的的ssDNA分子正结合池中减去获得自(d)的ssDNA分子，并鉴定与所述感兴趣的靶标特异性结合的ssDNA分子。


2.如权利要求1所述的方法，其中通过以下步骤选择(b)中基本上与靶标物结合的ssDNA分子的池：
(i)使输入ssDNA文库与靶标物接触，其中在靶标和输入文库中存在的多个ssDNA分子之间形成复合物；
(ii)使用氧化石墨烯(GO)溶液将步骤(i)中形成的ssDNA:靶标复合物与未结合的ssDNA分子分隔，并分离所述复合物中的ssDNA分子以产生针对靶标的ssDNA分子的子集；
(iii)使(ii)中的ssDNA分子的子集与相同的靶标接触，其中在靶标和ssDNA分子子集中存在的第二群ssDNA分子之间形成复合物，以产生针对靶标的ssDNA分子的第二子集；和
(iv)任选地将步骤(ii)至(iii)重复一轮、两轮、三轮、四轮或更多轮以产生各自的ssDNA分子的第三、第四、第五、第六或更多子集，从而在最终轮次后产生基本上与靶标结合的ssDNA分子的富集池。


3.如权利要求2所述的方法，其中，通过芯片上正选择过程，使用来自(b)的ssDNA分子靶标结合池、相同的靶标和包被有与ssDNA分子的恒定序列互补的短寡核苷酸的固体支持物，来选择(c)中的ssDNA分子正结合池。


4.如权利要求3所述的方法，其中，所述芯片上正选择过程包括以下步骤：
(i)将获得自(b)的sDNA分子靶标结合s池与相同的靶标在缓冲溶液中混合，并诱导它们彼此结合；
(ii)使步骤(i)的混合物与固体支持物接触，所述固体支持物的表面共价包被有与ssDNA分子的恒定序列互补的短寡核苷酸；
(iii)收集含有不与固体支持物结合的ssDNA:靶标复合物的流过物；
(iv)任选地使收集的流过物再次与包被有互补寡核苷酸的固体支持物接触两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次或更多次；和
(v)在最终孵育后，除去靶标并收集所富集的ssDNA分子的子集。


5.如权利要求3所述的方法，其中，使用(c)中的ssDNA分子正结合池以及包被有与ssDNA分子的恒定序列互补的短寡核苷酸的固体支持物，通过芯片上非结合反向过程，选择在靶标不存在下不与互补序列杂交的ssDNA分子。


6.如权利要求3所述的方法，其中，通过芯片上反向结合过程，使用(c)中的ssDNA分子正结合池、一个或多个反向靶标以及包被有与ssDNA分子的恒定序列互补的短寡核苷酸的固体支持物，选择基本上与反向靶标结合的ssDNA分子。


7.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(f)对获得自步骤(b)至(d)的每个池中的ssDNA分子进行扩增和测序；和
(g)为每个ssDNA分子池生成序列图，分析序列信息，并选择在互补序列存在下特异且优选结合感兴趣的靶标的最终ssDNA分子池。


8.如权利要求7所述的方法，其中所述步骤(g)包括：
(i)对在(b)、(c)和(d)步骤中鉴定的所有ssDNA分子进行扩增，并对每个池中的每个序列进行条形码化；
(ii)将每个池中的序列合并在一起，并一起进行测序；
(iii)分析来自(ii)的数据，并根据条形码信息将每个序列的数据分离到原始池中；
(iv)为每个单独的池生成代表所述池中每个序列的频率的热图；和
(v)从(c)中的ssDNA分子正结合池的热图中，减去在靶标物不存在下不与所述互补序列杂交的ssDNA分子池的热图中的序列，以及基本上与反向靶标结合的ssDNA分子池中的序列，
其中步骤(v)之后的序列最终池代表了与感兴趣的靶标特异性结合并优选在各种短互补序列的结合竞争下与感兴趣的靶标结合的候选适体。


9.如权利要求8所述的方法，其中所述方法进一步包括从(b)中的ssDNA分子靶标结合池中减去来自ssDNA分子的人工池的任何序列，其中所述ssDNA分子的人工池通过输入DNA文库的PCR扩增和链分离而产生，其代表了通过PCR扩增过度扩增的序列。


10.如权利要求9所述的方法，其中对最终池的序列的序列相似性和二级结构进行分析。


11.如权利要求7所述的方法，其中通过PCR并使用Cy5标记的引物和生物素化的引物，对每个池中的ssDNA分子的序列进行扩增。


12.如权利要求1所述的方法，其中所述靶标是过敏原。


13.以高特异性和高亲和力与感兴趣的靶标结合的适体，其中所述适体在感兴趣的靶标存在下不与其互补序列杂交。


14.如权利要求13所述的适体，其中所述靶标是过敏原。


15.如权利要求14所述的适体，其中所述过敏原是花生，且对花生特异的适体包含选自由SEQIDNO.3至1002组成的组的核酸序列。


16.如权利要求15所述的适体，其中所述对花生特异的适体包含选自由SEQIDNO.1003至4002组成的组的核酸序列。


17.如权利要求14所述的适体，其中所述过敏原是杏仁，且对杏仁特异的适体包含选自由SEQIDNO.4003至5002组成的组的核酸序列。


18.如权利要求17所述的适体，其中所述对杏仁特异的适体包含选自由SEQIDNO.5003至8002组成的组的核酸序列。


19.如权利要求14所述的适体，其中所述过敏原是巴西坚果，且对巴西坚果特异的适体包含选自由SEQIDNO.8003至9002组成的组的核酸序列。


20.如权利要求19所述的适体，其中所述对巴西坚果特异的适体包含选自由SEQIDNO.9003至12002组成的组的核酸序列。


21.如权利要求14所述的适体，其中所述过敏原是腰果，且对腰果特异的适体包含选自由SEQIDNO.12003至13002组成的组的核酸序列。


22.如权利要求21所述的适体，其中所述对腰果特异的适体包含选自由SEQIDNO.13003至16002组成的组的核酸序列。


23.如权利要求14所述的适体，其中所述过敏原是榛子，且对榛子特异的适体包含选自由SEQIDNO.16003至17002组成的组的核酸序列。


24.如权利要求23所述的适体，其中所述对榛子特异的适体包含选自由SEQIDNO.17003至20002组成的组的核酸序列。


25.如权利要求14所述的适体，其中所述过敏原是山核桃，且对山核桃特异的适体包含选自由SEQIDNO.20003至21002组成的组的核酸序列。


26.如权利要求25所述的适体，其中所述对山核桃特异的适体包含选自由SEQIDNO.21003至24002组成的组的核酸序列。


27.如权利要求14所述的适体，其中所述过敏原是开心果，且对开心果特异的适体包含选自由SEQIDNO.24003至25002组成的组的核酸序列。


28.如权利要求27所述的适体，其中所述对开心果特异的适体包含选自由SEQIDNO.25003至28002组成的组的核酸序列。


29.如权利要求14所述的适体，其中所述过...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·吉尔博格芬，S·E·斯蒂德哈姆，O·J·阿利，
申请(专利权)人：多茨技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US