对花青染料存在下的扩增抑制具有抗性的突变型Taq聚合酶制造技术

本发明专利技术包括一种突变型Taq聚合酶或其生物活性片段，该突变型Taq聚合酶或其生物活性片段可以与野生型Taq聚合酶相比显著地延伸和扩增目标序列，其中延伸混合物包括不对称的花青染料，包括SYBR Green I。所述突变型Taq聚合酶或其生物活性片段具有表I所示的区别于野生型的一种或多种取代。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对花青染料存在下的扩增抑制具有抗性的突变型Taq聚合酶序列表本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，在此通过全文引用并入本文。所述ASCII副本创建于2020年5月5日，名为Abclonal-SYBR_SL.txt，大小为2,614,903字节。
技术介绍
在DNA扩增的聚合酶链反应(PCR)中，目的序列:引物:聚合酶混合物经历不同温度下加热的连续轮次，使目的DNA链去退火(通常在约90-99℃下进行)，引物:目的DNA链退火(通常在约40-70℃下进行)，以及DNA聚合酶介导的引物延伸(通常在约50-72℃下进行)，以产生新的互补扩增子链。反应可包括多达25-45轮循环以产生足够的扩增产物。PCR通常使用热稳定的DNA聚合酶(Taq聚合酶是最广泛使用的)进行，这种酶可以承受高温去退火而不会因热诱导的蛋白质变性而失活。众所周知，某些试剂或条件的存在可降低PCR的速度。这可能是一个重大的商业劣势，因为随着反应的放缓，成本增加，需要使用更多的加热:冷却循环。SYBRTMGreenI核酸凝胶染色，DMSO中10,000倍浓缩(以下“SY本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.突变型Taq聚合酶，其包含一种或更多个SEQ ID NO:4到SEQ ID NO:482中偶数序列所示的以下氨基酸突变，并且其中所述突变型聚合酶的剩余部分与野生型Taq聚合酶具有至少80％的氨基酸序列同一性，所述野生型Taq聚合酶如SEQ ID NO:484所示但不包含SEQID NO:484中C端的六元组氨酸标签：E9K(SEQ ID NO:4-5),L15S(SEQ ID NO:6-7),H20E(SEQ ID NO:8-9),S50I(SEQ ID NO:10-11),L52S(SEQ ID NO:12-13),A54F(SEQ ID NO:14-15),D58R(SEQ ID NO...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190514 US 62/847,812;20200511 US 16/872,2001.突变型Taq聚合酶，其包含一种或更多个SEQIDNO:4到SEQIDNO:482中偶数序列所示的以下氨基酸突变，并且其中所述突变型聚合酶的剩余部分与野生型Taq聚合酶具有至少80％的氨基酸序列同一性，所述野生型Taq聚合酶如SEQIDNO:484所示但不包含SEQIDNO:484中C端的六元组氨酸标签：E9K(SEQIDNO:4-5),L15S(SEQIDNO:6-7),H20E(SEQIDNO:8-9),S50I(SEQIDNO:10-11),L52S(SEQIDNO:12-13),A54F(SEQIDNO:14-15),D58R(SEQIDNO:16-17),G59P(SEQIDNO:18-19),D60R(SEQIDNO:20-21),A61F(SEQIDNO:22-23),V62S(SEQIDNO:24-25),I63S(SEQIDNO:26-27),V65S(SEQIDNO:28-29),A68I(SEQIDNO:30-31),F92A(SEQIDNO:36-37),P93G(SEQIDNO:38-39),A97F(SEQIDNO:40-41),E101K(SEQIDNO:42-43),V103S(SEQIDNO:44-45),L108S(SEQIDNO:46-47),R110D(SEQIDNO:48-49),L111S(SEQIDNO:50-51),E112K(SEQIDNO:52-53),Y116A(SEQIDNO:54-55),E117K(SEQIDNO:56-57),A118F(SEQIDNO:58-59),E130K(SEQIDNO:60-61),K131E(SEQIDNO:62-63),E132K(SEQIDNO:64-65),A141F(SEQIDNO:66-67),D144R(SEQIDNO:68-69),I163S(SEQIDNO:70-71),E170K(SEQIDNO:72-73),E189A(SEQIDNO:74-75),E189K(SEQIDNO:76-77),E189P(SEQIDNO:78-79),E189T(SEQIDNO:80-81),E189W(SEQIDNO:82-83),E201K(SEQIDNO:84-85),K219E(SEQIDNO:88-89),D222R(SEQIDNO:90-91),A227F(SEQIDNO:92-93),E230A(SEQIDNO:94-95),E230C(SEQIDNO:96-97),E230G(SEQIDNO:98-99),E230K(SEQIDNO:100-101),E230N(SEQIDNO:102-103),E230Q(SEQIDNO:104-105),E230R(SEQIDNO:106-107),E230V(SEQIDNO:108-109),E230W(SEQIDNO:110-111),W243A(SEQIDNO:112-113),R261D(SEQIDNO:114-115),R262D(SEQIDNO:116-117),E274K(SEQIDNO:118-119),R275D(SEQIDNO:120-121),L282S(SEQIDNO:122-123),E288K(SEQIDNO:124-125),S290I(SEQIDNO:126-127),F309A(SEQIDNO:128-129),D320R(SEQIDNO:132-133),L322S(SEQIDNO:134-135),D381R(SEQIDNO:136-137),N384R(SEQIDNO:138-139),E401K(SEQIDNO:140-141),G403P(SEQIDNO:142-143),A407F(SEQIDNO:144-145),D452R(SEQIDNO:146-147),V453S(SEQIDNO:148-149),A454F(SEQIDNO:150-151),Y455A(SEQIDNO:152-153),E465K(SEQIDNO:154-155),E466K(SEQIDNO:156-157),L477S(SEQIDNO:158-159),N485R(SEQIDNO:160-161),Q489R(SEQIDNO:162-163),G504A(SEQIDNO:164-165),E507A(SEQIDNO:166-167),E507G(SEQIDNO:168-169),E507K(SEQIDNO:170-171),E507L(SEQIDNO:172-173),E507M(SEQIDNO:174-175),E507P(SEQIDNO:176-177),E507R(SEQIDNO:178-179),E507S(SEQIDNO:180-181),E507T(SEQIDNO:182-183),T509I(SEQIDNO:184-185),E520F(SEQIDNO:186-187),E520H(SEQIDNO:188-189),E520K(SEQIDNO:190-191),E520M(SEQIDNO:192-193),E520N(SEQIDNO:194-195),E520Q(SEQIDNO:196-197),E520R(SEQIDNO:198-199),E520S(SEQIDNO:200-201),E520T(SEQIDNO:202-203),E520V(SEQIDNO:204-205),E520Y(SEQIDNO:206-207),Q534R(SEQIDNO:208-209),E537A(SEQIDNO:210-211),E537F(SEQIDNO:212-213),E537G(SEQIDNO:214-215),E537H(SEQIDNO:216-217),E537I(SEQIDNO:218-219),E537K(SEQIDNO:220-221),E537L(SEQIDNO:222-223),E537Q(SEQIDNO:224-225),E537R(SEQIDNO:226-227),E537S(SEQIDNO:228-229),E537T(SEQIDNO:230-231),E537V(SEQIDNO:232-233),E537Y(SEQIDNO:234-235),T539S(SEQIDNO:236-237),D547R(SEQIDNO:238-239),D578F(SEQIDNO:240-241),D578H(SEQIDNO:244-245),D578K(SEQIDNO:246-247),D578L(SEQIDNO:248-249),D578M(SEQIDNO:250-251),D578Q(SEQIDNO:252-253),D578R(SEQIDNO:254-255),D578S(SEQIDNO:256-257),D578T(SEQIDNO:258-259),D578V(SEQIDNO:260-261),D578W(SEQIDNO:262-263),D578Y(SEQIDNO:264-265),P701G(SEQIDNO:268-269),E708K(SEQIDNO:270-271),D732A(SEQIDNO:272-273),D732F(SEQIDNO:274-275),D732G(SEQIDNO:276-277),D732H(SEQIDNO:278-279),D732I(SEQIDNO:280-281),D732K(SEQIDNO:282-283),D732M(SEQIDNO:284-285),D732N(SEQIDNO:286-287),D732R(SEQIDNO:288-289),D732Q(SEQIDNO:290-291),D732S(SEQIDNO:292-293),D732T(SEQIDNO:294-295),E742A(SEQIDNO:296-297),E742F(SEQIDNO:298-299),E742I(SEQIDNO:302-303),E742K(SEQIDNO:304-305),E742L(SEQIDNO:306-307),E742M(SEQIDNO:308-309),E742N(SEQIDNO:310-311),E742P(SEQIDNO:312-313),E742T(SEQIDNO:314-315),E742V(SEQIDNO:316-317),E742W(SEQIDNO:318-319),E742Y(SEQIDNO:320-321),Q782A(SEQIDNO:322-323),R801D(SEQIDNO:324-325),K804E(SEQIDNO:326-327),E820A(SEQIDNO:328-329),E39K/E189K(SEQIDNO:472-473),E39K/E230K(SEQIDNO:474-475),E39K/D320R(SEQIDNO:476-477),E39K/E507K(SEQIDNO:478-479),E39K/E520K(SEQIDNO:480-481),E39K/E537K(SEQIDNO:482-483),E189K/E230K(SEQIDNO:330-331),E189K/E507K(SEQIDNO:332-333),E189K/E520K(SEQIDNO:334-335),E189K/E537K(SEQIDNO:336-337),E189K/D578R(SEQIDNO:338-339),E189K/D732R(SEQIDNO:340-341),E189K/E742K(SEQIDNO:342-343),E230K/E507K(SEQIDNO:344-345),E230K/E520K(SEQIDNO:346-347),E230K/E537K(SEQIDNO:348-349),E230K/D578R(SEQIDNO:350-351),E230K/D732R(SEQIDNO:352-353),E230K/E742K(SEQIDNO:354-355),E507K/E520K(SEQIDNO:356-357),E507K/E537K(SEQIDNO:358-359),E507K/D578R(SEQIDNO:360-361),E507K/E742K(SEQIDNO:362-363),E520K/E537K(SEQIDNO:364-365),E520K/D578R(SEQIDNO:366-367),E520K/D732R(SEQIDNO:368-369),E520K/E742K(SEQIDNO:370-371),E537K/D578R(SEQIDNO:372-373),E537K/D732R(SEQIDNO:374-375),E537K/E742K(SEQIDNO:376-377),D578R/D732R(SEQIDNO:378-379),D578R/E742K(SEQIDNO:380-381),D732R/E742K(SEQIDNO:382-383),E189K/E230K/E507K(SEQIDNO:384-385),E189K/E230K/E520K(SEQIDNO:386-387),E189K/E507K/E520K(SEQIDNO:388-389),E189K/E230K/E537K(SEQIDNO:390-391),E189K/E507K/E537K(SEQIDNO:392-393),E189K/E520K/E537K(SEQIDNO:394-395),E230K/E507K/E537K(SEQIDNO:396-397),E230K/E520K/E537K(SEQIDNO:398-399),E507K/E520K/E537K(SEQIDNO:400-401),E189K/E230K/D578R(SEQIDNO:402-403),E189K/E507K/D578R(SEQIDNO:404-405),E189K/E520K/D578R(SEQIDNO: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2.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其在含有花青染料的PCR混合物中具有活性。


3.根据权利要求2所述的突变型Taq聚合酶，其中所述花青染料是SYBRGreenI。


4.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其中所述突变型Taq聚合酶的生物活性片段包含一个或更多个SEQIDNO:4到SEQIDNO:482中偶数序列所示的氨基酸突变。


5.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其中所述突变型聚合酶的剩余部分与野生型Taq聚合酶具有至少90％的同一性。


6.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其中所述突变型聚合酶的剩余部分与野生型Taq聚合酶具有至少99％的同一性。


7.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其具有SEQIDNO:4到SEQIDNO:482中偶数序列之一的序列。


8.DNA序列，其编码权利要求1所述的突变型Taq聚合酶。


9.DNA序列，其编码权利要求6所述的突变型Taq聚合酶。


10.根据权利要求8所述的DNA序列，其为SEQIDNO:5到SEQIDNO:483中奇数序列之一。


11.载体，其整合有权利要求4所述的DNA序列。


12.载体，其整合有权利要求10所述的DNA序列。


13.细胞，其被权利要求4所述的DNA序列转化并表达权利要求4所述的DNA序列。


14.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶或其生物活性片段，其具有以下突变体之一的偶数氨基酸序列：F92A；P93G；A97F；E101K；V103S；L108S；R110D；L111S；E112K；Y116A；E117K；A118F；E130K；K131E；WT；E9K；L15S；H20E；S50I；L52S；A54F；D58R；G59P；D60R；A61F；V62S；I63S；V65S；A68I；E230N；E230Q；E230R；E230V；E230W；W243A；R261D；R262D；E274K；R275D；L282S；E288K；S290K；F309A；E132K；A141F；D144R；I163S；E170K；E189T；E189W；E201K；K219E；D222R；A227F；E230A；E230C；N485R；Q489R；G504A；E507L；E507M；E507P；E507R；T509I；E530F；E520H；E520K；E520M；E520N；D320R；L322S；D381R；N384R；E401K；G403P；A407F；D452R；E230V；E230W；V453S；A454F；Y455A；E465K；E466K；L477S；E537SLE537TLE537VLE537YLT539SLD547RLD578FLD578H；D578K；D578L；D578M；D578R；D578S；D578T；D578V；D578W；E520Q；E520R；E520S；E520T；E530V；E520Y；Q534R；E537A；E537F；E537H；E537I；E537K；E537L；E537Q；E537R；E742FLE742K；E742M；E742N；E742P；E742V；E742W；E742Y；Q782A；R801D；K804E；E820A；D578Y；P701G；E798K；D732A；D732K；D732M；D732N；D732R；D732T；E742A；E189K/E230K/E507K；E189K/E230K/E520K；E189K/E230K/E537K；E189K/E507K/E537K；E189K/E520K/E537K；E230K/E507K/E537K；E537G；E189A；E189P；E507T；E578Q；D732F；D732G；D732H；D732I；D732Q；D732S；D230G；D507G；E189K/E230K；E189K/E507K；E189K/E520K；E189K/E537K；E189K/D732R；E189K/E742K；D578R/D732R；D578R/E742K；D732R/E742K；E230K/D578R；E230K/E742K；E507K/E537K；E507K/D578R；E507K/D732R；E742I；E742L；E742T；E507K/E742K；E537K/D732R；E537K/E742K；E742V；E742Y；E230K/D732R；E520K/E742K；E537K/D578R；E189K/D578R；E230K/E507K；E230K/E520K；E230K/E537；E507K/E520K；E520K/E537K；E520K/D578R；E520K/D732R；E230K/E520K/E537K；E507K/E520K/E537K；E189K/E230K/D578R；E189K/E507K/D578R；E189K/E520K/D578R；E230K/E507K/D578R；E230K/E520K/D732R；E230K/D578R/E742K；E230K/D732R/E742K；E507K/E520K/E742K；E507K/E537K/E742K；E507K/D578R/E742K；E507K/D732R/E742K；E39K/E507K；E39K/E520K；E39K/E537K；E39K/E189K；E39K/E230K；E39K/D320R；E537K/D578R/E742K；E537K/D732R/E742K；D578R/D732R/E742K；E230K/E520K/D578R；E507K/E520K/D578R；E520K/D537K/D578R；E189K/E230K/D732R；E189K/E507K/D732R；E189K/E520K/D732R；E189K/E230K/E742K；E189K/E507K/E742K；E189K/E520K/E742K；E189K/E537K/E742K；E189K/D578R/E742K；E189K/D732R/E742K；E230K/E507K/E742K；E2...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱振宇，孙大鹏，
申请(专利权)人：武汉爱博泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42