一种载脂蛋白J活性的测定方法技术

本发明专利技术提供了一种载脂蛋白J活性的测定方法，向谷胱甘肽S‑转移酶中加入适量的载脂蛋白J，通过测定谷胱甘肽S‑转移酶在热处理条件处理前、后的比活的变化来计算载脂蛋白J的活性。本发明专利技术首次利用载脂蛋白J能够抑制蛋白在加热后形成聚集和沉淀的特性，通过检测在加热前后谷胱甘肽S‑转移酶的活性变化，来测定载脂蛋白J的比活性，相关操作简单，精确度高。

【技术实现步骤摘要】
一种载脂蛋白J活性的测定方法
本专利技术涉及检测
，特别涉及一种载脂蛋白J活性的测定方法。
技术介绍
载脂蛋白J(ApoJ,又称clusterin)是一种多功能的糖蛋白，广泛存在于人体多种组织及体液中。载脂蛋白J是一种相对分子质量为75～80KDa的异质二聚体蛋白质，能够与人血浆高密度脂蛋白(HDL)和极高密度脂蛋白(VHDL)相结合。载脂蛋白J的功能复杂，参与包括补体功能的调节、抑制凋亡和炎症、参与脂质的运输等多种体内生理过程，目前已经发现载脂蛋白J在多种疾病过程中都有高度表达，如神经退行性病变、动脉粥样硬化、心肌梗死、肿瘤等。分子伴侣是一类与其他蛋白不稳定构象相结合并使之稳定的蛋白，它们通过控制结合和释放来帮助被结合多肽在体内的折叠、组装、转运或降解等。1997年有报道称，载脂蛋白J启动子中的一个14bp的元件，其序列在脊椎动物中是严格保守的，被转录因子HSF1特异性识别，并能在瞬时表达分析中介导热休克诱导的转录，这说明载脂蛋白J是一种热休克蛋白。载脂蛋白J和小热休克蛋白(sHsps)是一类功能相似的分子伴侣蛋白，尽管它们之间缺乏明显的序列相似性。这两个分子伴侣蛋白都能有效地阻止目标蛋白在应激条件下的形成聚集和沉淀，如升高的温度、还原和氧化。研究表明，ApoJ蛋白可以抑制蛋白淀粉样变性聚集相关途径，这些淀粉样变性聚集蛋白包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)等蛋白。例如在生理浓度下，载脂蛋白J能有效保护谷胱甘肽S-转移酶和过氧化氢酶不受热沉淀的影响，并能有效保护α-乳蛋白和牛血清白蛋白不受二硫苏糖醇还原沉淀的影响。除此之外，载脂蛋白J还能够抑制未稀释的人血清中应激诱导的蛋白质沉淀。载脂蛋白J通过不依赖ATP的机制发挥分子伴侣作用，不可逆地与应激蛋白结合形成可溶的高分子量复合物，保持受体蛋白空间稳定，减少由于环境因素导致受体蛋白错误折叠。在此过程中，它们作用于缓慢的、不折叠的蛋白质途径。这两种蛋白的构象动态和聚集状态可能对其伴侣功能起着至关重要的作用。亚基交换可能在调节伴侣作用中起重要作用；蛋白质的游离形式可能是体现伴侣活性的主要形态，而非聚集状态。GST在生物体内是一种重要的解毒酶系，其催化外源或内源性毒素与谷胱甘肽结合，形成易溶于水或毒性较小的化合物排除体外，从而保护机体的正常功能。AmyR.Wyatt等人发现ApoJ蛋白能够显著性抑制GST因热处理而变性聚集，从而保持GST的空间构象。但是没有指出载脂蛋白J是否对GST的酶活性也有保护作用。RebeccaA等人提供一个定量描述蛋白热变性实验方法，即在高温处理环境中，GST将因热聚集变性形成蛋白错误折叠聚集，且蛋白聚集程度在360nm处有最大光吸收值。故而360nm吸光值可以反映GST聚集折叠程度或者热变性程度。GST活性测定原理是在GST的催化下1,2-二氯-4-硝基苯(CDNB)分子上的氯原子与谷胱甘肽上的巯基发生亲电反应，产物在340nm、344nm处有吸收，通过紫外分光光度计可以进行酶活测定。为验证载脂蛋白J保护GST活性，我们利用此方法检测加热后在载脂蛋白J存在的情况下，GST活性的变化，并在此基础上建立了一套用于测定载脂蛋白J活性的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提出一种载脂蛋白J活性的测定方法，利用载脂蛋白J具有类似热激蛋白的分子伴侣功能能够抑制蛋白在加热后形成聚集和沉淀的作用，通过检测在加热处理过程中GST的活性变化情况来定义载脂蛋白J的活性，以解决目前尚没有快速、准确测定载脂蛋白J活性方法的问题。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种载脂蛋白J活性的测定方法，向GST中加入适量的载脂蛋白J，通过测定GST在热处理条件处理前、后的比活的变化来计算载脂蛋白J的活性。所述载脂蛋白J可以使天然载脂蛋白，也可以是重组表达的载脂蛋白。进一步的，所述测定方法包括：S1、取载脂蛋白J和GST按至少3个不同比例混合均匀，补加PB缓冲液至一定体积；优选的，选择5-9个不同比例的载脂蛋白J和GST进行混合；更优选的，加入同一浓度的GST，按照GST浓度加入不同比例的载脂蛋白J进行混合；S2、升温进行热处理，例如40-80℃加热3-10min；S3、测定加热前、后GST的酶活并计算GST相应的比活；S4、根据测得的GST比活与载脂蛋白J的浓度关系进行拟合，按加热前GST初始比活的1/2即EC50对应载脂蛋白J的浓度为1unit/ml，计算载脂蛋白J的比活。更进一步的，所述热处理条件为40-80℃加热3-30min。所述热处理条件可以是40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴处理，加热时间可以是3min、5min、10min、20min或30min。进一步的，步骤S3中GST酶活的测定方法为：S31、向pH6.50.2M磷酸缓冲液加入0.25ml20mMCDNB溶液及0.5ml10mMGSH溶液，并加水稀释至V1，例如V1为10ml，配置底物反应液；S32、将配制好的底物反应液放置进行20-30℃预热；所述预热温度可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃或30℃。S33、取待测酶液加到预热的底物反应液中，开始计时，迅速吹打均匀后，各取V2体积的待测液，例如V2为200μL；加到酶标板上的两个孔中，测定反应1min和T分钟(T＞1)后的吸光值，记录数据；S34、按如下公式计算GST的酶活：GST酶活(unit/ml)＝ΔA340差值*106*V反总*稀释倍数/ε/d/V样/△T，其中：ΔA340差值为波长340nm时吸光度净升值；ε为25℃、波长340nm处结合产物的摩尔吸光系数为9600mol-1*cm-1*L；V反总为最终反应体积(L)；V样为标本体积(ml)；d：酶标板光径约为0.552cm；△T＝T-1min。更进一步的，GST比活的计算公式为：GST比活＝GST酶活/Cpr，其中Cpr为蛋白浓度(mg/ml)。进一步的，步骤S33中每次检测吸光度前震荡2s。也可以根据具体情况震荡1s或3s。进一步的，步骤S4中根据测得的GST比活与载脂蛋白J的浓度关系进行拟合为以GST比活为y轴，载脂蛋白J的浓度为x轴，进行S型曲线拟合。更进一步的，载脂蛋白J的酶活是指按GST活性EC50对应的载脂蛋白J的浓度的酶活定义为1unit/ml。进一步的，步骤S1中PB缓冲液的浓度为20mM，pH7.4。进一步的，步骤S2为60℃加热5min后冷却至室温。优选的，采用试剂包含：1)PB缓冲溶液：pH6.5的0.2MPB、pH7.4的0.02MPB；2)载脂蛋白J及其溶剂；3)1mg/mlGST溶液，用20mM，pH7.4的PB缓冲液配制；4)1mg/ml的BSA(牛血清白蛋白)溶液，用20mM，pH7.4的PB缓冲液配制；5)20mM1-氯2,4-二硝基苯溶液(CDNB)；6)10mMGSH溶液，临用前配制。在没有特殊说明的情况下，本申请所述试剂均为本领域技术人员按常规方法制备的试剂。优选的，采用如下步骤进行测定：1)热聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种载脂蛋白J活性的测定方法，其特征在于，向谷胱甘肽S-转移酶(GST)中加入适量的载脂蛋白J，通过测定谷胱甘肽S-转移酶在热处理前、后的比活的变化来计算载脂蛋白J的活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种载脂蛋白J活性的测定方法，其特征在于，向谷胱甘肽S-转移酶(GST)中加入适量的载脂蛋白J，通过测定谷胱甘肽S-转移酶在热处理前、后的比活的变化来计算载脂蛋白J的活性。


2.根据权利要求1所述载脂蛋白J活性的测定方法，其特征在于，包括：S1、取载脂蛋白J和谷胱甘肽S-转移酶按至少3个不同比例混合均匀，补加PB缓冲液至一定体积；S2、升温进行热处理；S3、测定加热前、后的谷胱甘肽S-转移酶的酶活并计算相应的比活；S4、根据测得的谷胱甘肽S-转移酶比活与载脂蛋白J的浓度关系进行拟合，将加热前GST的初始比活的1/2对应载脂蛋白J的浓度定义为1unit/ml，计算载脂蛋白J的比活。


3.根据权利要求2所述载脂蛋白J活性的测定方法，其特征在于，所述热处理的条件为40-80℃加热3-30min。


4.根据权利要求2所述的载脂蛋白J活性的测定方法，其特征在于，步骤S3中谷胱甘肽S-转移酶酶活的测定方法为：
S31、向磷酸缓冲液加入CDNB溶液及GSH溶液，并加水稀释至V1，配置底物反应液；
S32、将配制好的底物反应液放置进行20-30℃预热；
S33、取待测酶液加到预热的底物反应液中，开始计时，迅速吹打均匀后，取V2体积的待测液，加到酶标板上的两个孔中，测定反...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翔，杜佩云，蔡文凯，
申请(专利权)人：厦门德馨尚品医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35