一种DNA连接酶的酶活测定方法技术

本发明专利技术提供了一种DNA连接酶的酶活测定方法，包括：(1)提供RNA单链及与之互补的受体DNA单链和供体DNA单链；(2)退火获得DNA/RNA杂合双链，受体DNA单链的3’端羟基与供体DNA单链的5’端磷酸基团相邻但存在缺刻，该杂合双链的荧光基团产生荧光；(3)以待测DNA连接酶处理DNA/RNA杂合双链，获得缺刻处连接的完整DNA/RNA杂合双链，该杂合双链的荧光基团保持荧光；(4)对完整DNA/RNA杂合双链直接或加热变性后以核糖核酸酶消化，留下DNA连接产物，根据其荧光强度进行定量，确定待测DNA连接酶酶活。本发明专利技术的方法定量准确，操作过程简便、快速，不涉及放射性物质的运用。同时，本发明专利技术也优化设计了适用于酶活测定、灵敏度高的具体检测序列。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA连接酶的酶活测定方法
本专利技术属于生化
，具体来说涉及一种DNA连接酶的活性测定方法。
技术介绍
DNA连接酶是1967年在大肠杆菌细胞中发现的，是生物体内重要的酶，其所催化的反应在DNA的复制和修复过程中起着重要的作用。DNA连接酶分为两大类：一类是依赖ATP的DNA连接酶，其利用ATP的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键；另一类是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的DNA连接酶，其利用NAD+的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键。PBCV-1DNA连接酶(PBCV-1DNALigase)，也被称为SplintR@连接酶或ChorellavirusDNA连接酶，是一种ATP依赖的DNA连接酶，它能够高效催化与一条互补的RNA单链配对的两条相邻较小的DNA单链的连接；这两条相邻的DNA链中，提供3’羟基的被称之为受体DNA链(AcceptorDNA)，提供5’磷酸的被称之为供体DNA链(DonorDNA)；在这个连接过程中需要一条互补的RNA链在两条DNA单链间起“夹板”或“桥梁”的固定作用。该酶对于通过RN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA连接酶的酶活测定方法，其特征在于，所述方法包括：/n(1)提供RNA单链、分别与该RNA单链的3’端区域和5’端区域互补的受体DNA单链和供体DNA单链；且该受体DNA单链的5’端携带荧光基团、该供体DNA单链的3’端携带淬灭基团；/n(2)将(1)中各单链退火获得DNA/RNA杂合双链；受体DNA单链的3’端羟基与供体DNA单链的5’端磷酸基团相邻但存在缺刻，该杂合双链的荧光基团产生荧光；/n(3)以待测DNA连接酶处理(2)的DNA/RNA杂合双链，获得缺刻处连接的完整DNA/RNA杂合双链，该杂合双链的荧光基团保持荧光；/n(4)对(3)的完整DNA/RNA杂合双链直接或加...

【技术特征摘要】
1.一种DNA连接酶的酶活测定方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供RNA单链、分别与该RNA单链的3’端区域和5’端区域互补的受体DNA单链和供体DNA单链；且该受体DNA单链的5’端携带荧光基团、该供体DNA单链的3’端携带淬灭基团；
(2)将(1)中各单链退火获得DNA/RNA杂合双链；受体DNA单链的3’端羟基与供体DNA单链的5’端磷酸基团相邻但存在缺刻，该杂合双链的荧光基团产生荧光；
(3)以待测DNA连接酶处理(2)的DNA/RNA杂合双链，获得缺刻处连接的完整DNA/RNA杂合双链，该杂合双链的荧光基团保持荧光；
(4)对(3)的完整DNA/RNA杂合双链直接或加热变性后以核糖核酸酶消化，留下DNA连接产物、其荧光被淬灭，根据其荧光强度进行定量，从而确定待测DNA连接酶的酶活。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA连接酶是催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键的DNA连接酶；较佳地，所述DNA连接酶在一条DNA的3’端羟基与另一DNA的5’端磷酸基团之间形成磷酸二酯键；较佳地，所述DNA连接酶包括依赖ATP的DNA连接酶或依赖NAD+的DNA连接酶；更佳地，所述DNA连接酶包括：PBCV-1DNA连接酶、SplintR@连接酶、Chorella病毒DNA连接酶或T4DNA连接酶。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA单链为长度40～80个碱基的链，所述受体DNA单链为长度15～35个碱基的链，所述供体DNA单链为长度25～45个碱基的链；较佳地：
所述RNA单链、受体DNA单链和供体DNA单链的核苷酸序列分别如SEQIDNO:3、SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；或
所述RNA单链、受体DNA单链和供体DNA单链的核苷酸序列分别如SEQIDNO:6、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；或
所述RNA单链、受体DNA单链和供体DNA单链的核苷酸序列分别如SEQIDNO:9、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，退火时，所述RNA单链的摩尔数为受体DNA单链和供体DNA单链摩尔数之和的0.05-50倍，较佳的为0.1-10倍，更佳的为0.2-2倍，最佳的为0.5倍；其中受体DNA单链的摩尔数为供体DNA单链摩尔数的0.1-10倍，较佳的为0.2-5倍，更佳的为0.5-2倍，最佳的为1倍。


5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(4)中，所述核糖核酸酶在非变性条件下是特异性消化DNA/RNA杂交链中RNA单链的酶，或变性条件下消化RNA的内切酶或外切酶；较佳地包括：RNaseH，含有RNaseH酶活性的反转录酶如M-MuLV...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟琦巍，李升建，周靖晗，杨小丽，
申请(专利权)人：上海碧云天生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31