一株高效产酶的枯草芽孢菌株LC1-1及其产酶方法和应用技术

本发明专利技术涉及一株高效产壳聚糖酶的枯草芽孢菌株LC1‑1及其产酶方法和应用，该菌株于2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21809。所述枯草芽孢菌株LC1‑1能够在25‑65℃的温度下，pH为4.5‑8的条件下生产出壳聚糖酶，产酶过程无需壳聚糖诱导，通过碳源、氮源优化并对培养基成分优化，所获得的壳聚糖酶的产量高、稳定性好，且能够降解壳聚糖生成单糖、壳三糖和壳四糖，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一株高效产酶的枯草芽孢菌株LC1-1及其产酶方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一株高产壳聚糖酶的枯草芽孢菌LC1-1及其产酶方法和应用。
技术介绍
壳聚糖是指脱乙酰度高于55％的甲壳素产物，是目前发现的唯一天然阳离子多糖。虽然多项研究表明，壳聚糖在生物医学、农业、废水及废物处理、饮食(食品保鲜剂和防腐剂等)、化妆品领域有十分重要的应用，但由于其分子量较大，水溶性差，其应用也受到一定限制。壳寡糖又称低聚壳聚糖，是壳聚糖进一步降解的产物，分子量普遍低于3000Da，聚合度在2～20之间，水溶性较好，黏度较低，是一种功能性低聚糖。除具备壳聚糖特殊的生理活性外，壳寡糖在抑菌和抗肿瘤等方面生理活性更强。因此壳寡糖比壳聚糖具有更大的应用潜力。目前制备壳寡糖主要有物理法、化学法和酶法降解。利用化学反应制备壳寡糖，所得产物分子量分布范围较广，产品质量不均一，同时化学反应不易控制，容易产生污染，产品上残留的化学物质不易清除，产品的安全性有待考证。物理法制备壳寡糖需要额外的大型设备，投资较高，因此，当前很少有基于物理法的壳寡糖生产方式。酶法降解生产壳寡糖，分子量均一；同时，产品的生产不需要强酸强碱等极端条件，对能源的消耗低，生产过程安全绿色无污染；此外，降解的壳聚糖没有额外的化学物质残留，不需要过多的处理步骤，节约生产成本，产品的安全性也更好，因而酶法降解生产壳寡糖成为研究的热点。起初研究壳聚糖酶时，生物学家从自然界中大量筛选产壳聚糖酶的微生物。随后，国内外研究人员陆续地在细菌、真菌、放线菌中发现壳聚糖酶的存在。从自然界中筛选产酶微生物，主要不足之处在于，产酶效果较差，且一些产酶菌株需要经过诱导才能达到高产酶的效果。据统计，产壳聚糖酶的菌株包括，芽孢杆菌(Bacillussp.No.7-M)、环状芽孢杆菌(B.circulansMH-K)、灰色链霉菌(StreptomycesgriseusHuT6037)、链霉菌属(Streptomycessp.N174)、曲霉(Aspergillusoryzae)、链霉菌(Streptomycesclavuligerussp.P1)等。
技术实现思路
基于当前酶法生产壳寡糖的现状，本专利技术提供了一株能高效产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌，及其在生产壳聚糖酶中的应用。为了实现以上专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一株高效产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌LC1-1，该枯草芽孢杆菌于2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21809。进一步的，所述的枯草芽孢杆菌LC1-1，该菌能够高效生产壳聚糖酶，产酶无需壳聚糖诱导。进一步的，所述枯草芽孢杆菌的菌落为不规则形状，具有叶状边缘，表面色暗，不透明，直径2-3mm；其菌体在显微镜下为直杆状，芽孢中生。本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌LC1-1生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于，所述产酶方法包括如下步骤：(1)发酵：将枯草芽孢杆菌接种于培养基中，在温度为25℃-65℃，pH为4.5-8的条件下发酵，得到含有壳聚糖酶的发酵液；(2)分离：将含壳聚糖酶的发酵液离心，收集上清液；用20％～80％饱和度硫酸铵盐析，从发酵液中提取壳聚糖酶粗提物，透析除盐；(4)纯化：采用葡聚糖凝胶柱层析和离子交换层析，获得壳聚糖酶。进一步的，具体纯化方法为：(1)将硫酸铵沉淀得到的粗酶经过透析除盐后，先进行离子交换层析，待活性物质吸附于层析介质后，由低盐浓度缓冲液向高盐浓度缓冲液洗脱，分别收集不同盐浓度缓冲液的洗脱组分，对每一管进行活性测定确定活性峰，将活性溶液收集。(2)将收集到的活性物质进一步过葡聚糖凝胶G75，洗脱液为蒸馏水。进一步的，所述发酵温度为25℃～65℃，所述发酵pH为4.5～8。进一步的，所述发酵过程中的发酵时间为10-17小时。进一步的，所述培养基的碳源浓度为10-33g/L，优选的，碳源浓度为30g/L、22.7g/L。进一步的，所述培养基的氮源浓度为10-30g/L，优选的，氮源浓度为15g/L。进一步的，所述培养基成分为：碳源浓度为22.7g/L，氮源浓度15g/L；发酵条件为：装液量20％，接种量2.0％，温度34℃，pH为5.5，转速为180rpm。进一步的，发酵过程中所用的培养基组成重量份比例为酵母粉1～15份、氯化钠1～30份、胰蛋白胨1～30份、蔗糖1～50份、磷酸氢二钾1～10份、磷酸二氢钾1～10份。本专利技术还提供了枯草芽孢杆菌LC1-1根据上述方法所产的壳聚糖酶。进一步的，所述的壳聚糖酶的分子量为40-45kDa。进一步的，所述的壳聚糖酶能够降解壳聚糖生成单糖、壳三糖和壳四糖。进一步的，所述壳聚糖酶在前15min酶促反应迅速，并能于45min到达终点。进一步的，所述的壳聚糖酶能够耐受温度20～70℃，pH为3.7～10.8。进一步的，所述壳聚糖酶通过添加金属离子催化剂调整反应速度。进一步的，所述壳聚糖酶在前15min酶促反应迅速并能于45min到达终点。进一步的，所述壳聚糖酶通过添加金属离子催化剂调整反应速度：可以通过添加Mn2+促进酶促反应；也能够通过添加Zn2+和/或SDS和/或Fe3+和/或Cu2+和/或Fe2+抑制酶促反应。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：(1)本专利技术通过筛选提供了一株高效产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌LC1-1，该菌株能够高效生产壳聚糖酶，且产酶过程无需壳聚糖诱导，所产酶的分子量为40-45kDa，且在酸碱条件下稳定，具有一定温度耐受性和pH耐受性。(2)本专利技术通过单因素试验、响应面设计对碳源、氮源、温度、pH值等方面对生产条件进行优化，寻找最适的生产条件，该条件下生产的壳聚糖酶可达到32.23U/ml。(3)本专利技术提供一种壳聚糖酶制备方法，本专利技术优化工艺过程，在纯化过程中增加离子交换介质纯化和葡聚糖柱层析洗脱步骤，通过碳源、氮源、pH、温度、硫酸铵浓度等因素的摸索，提高壳聚糖酶的产酶效率和工艺生产的实用性。(4)本专利技术提供了一种壳聚糖酶，通常的壳聚糖酶降解壳聚糖的产物多为多糖，本专利技术所制备的壳聚糖酶能够降解壳聚糖生成成分单一的单糖、壳三糖和壳四糖，产酶速率稳定高效，前15min酶促反应迅速，45min即可达到反应终点。能够广泛地应用在卫生、食品、饲料、养殖、种植等领域。附图说明图1菌株在65℃条件下在LB培养基中的菌落形态及初筛培养基上的产透明圈情况。(a)LC1-1在LB平板上的菌落形态；(b)LC1-1在初筛培养基上产透明圈情况。图2单因素实验结果。(a)接种量对菌株LC1-1产壳聚糖酶的影响；(b)不同发酵温度对菌株LC1-1产壳聚糖酶的影响；(c)pH对菌株LC1-1产壳聚糖酶的影响；(d)转速对菌株LC1-1产壳聚糖酶的影响；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高效产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌LC1-1，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌于2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21809。/n

【技术特征摘要】
1.一株高效产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌LC1-1，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌于2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21809。


2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌LC1-1，其特征在于，该菌能高效生产壳聚糖酶，产酶过程无需壳聚糖诱导。


3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌LC1-1，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的菌落为不规则形状，具有叶状边缘，表面色暗，不透明，直径2-3mm；其菌体在显微镜下为直杆状，芽孢中生。


4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌LC1-1生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于所述产酶方法包括如下步骤：
（1）发酵：将枯草芽孢杆菌接种于培养基中，在温度为25℃-65℃，pH为4.5-8的条件下发酵，得到含有壳聚糖酶的发酵液；
（2）分离：将含壳聚糖酶的发酵液离心，收集上清液；用20%~80％饱和度硫酸铵盐析，从发酵液中提取壳聚糖酶粗提物，透析除盐；
纯化：采用葡聚糖凝胶柱层析和离子交换层析，获得壳聚糖酶。


5.根据权利要求4所述的生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于，所述发酵过程中的发酵时间为10-17小时。


6.根据权利要求4所述的生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于，所述培养基的碳源浓度为10-33g/L，优选的，碳源浓度为30g...

【专利技术属性】
技术研发人员：何增国，郭若琳，汤伟，孙晓雯，张军，唐涛，
申请(专利权)人：青岛海洋生物医药研究院股份有限公司，青岛百奥安泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37