一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法，步骤是1)纳米多孔金电极的制备及其表征；2)酶修饰电极的制备；3)以蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度Hcy产生的电流响应值，做出Hcy线性标准曲线；4)用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测含Hcy的尿液稀释样品。本发明专利技术的方法与其他检测方法相比，不需要昂贵的仪器和试剂，极大地降低了检测成本，且不需要复杂的样品前处理过程，操作简单，检测迅速。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法
本专利技术涉及一种同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)的检测方法，尤其涉及一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法。属于电化学分析测试领域。
技术介绍
同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)在人体血浆中主要以结合态形式存在，仅有约5％的Hcy以游离态的形式存在。结合态和游离态的Hcy量的总和即为总同型半胱氨酸(Totalhomocysteine，tHcy)。血浆中tHcy的正常含量在5-15μM范围内，血浆中tHcy水平异常升高即为高同型半胱氨酸血症。根据血浆中tHcy水平可分为轻、中度和重度高同型半胱氨酸血症。目前很多临床研究表明，血浆中异常水平的tHcy与心血管疾病、妊娠并发症、糖尿病、阿尔兹海默病、肾衰竭、抑郁症等多种疾病相关，并且tHcy水平越高，患病风险越高。检测血浆中tHcy可作为临床诊断和人体健康评估的一项重要参考指标。因此，tHcy的检测具有重大意义。目前已经有较多检测Hcy的报道，如高效液相色谱法、循环酶法和免疫荧光偏振法，这些方法需要昂贵的仪器和试剂，操作过程较为复杂且耗时长，无法广泛应用于Hcy的检测。因此，需要一种成本较低、操作简单和检测迅速的替代检测方法，以满足临床低成本快速准确检测Hcy的需求。近年来，电化学传感器技术因其检测耗时较短、易于上手操作、便于携带、成本较低等优势得到了研究者的广泛关注。纳米多孔金(Nanoporousgold，NPG)具有较高的比表面积、优异的导电性和催化性能、生物相容性、孔径可调、双连续开放结构和易于制备等优点，可作为良好的电极构建材料。为了进一步提高传感器的特异性，可利用特异性较强的酶与兼具结构和功能的纳米多孔金构建酶修饰电极。目前已有文献报道利用酶修饰电极检测葡萄糖、甘油三酯等物质。但通过在纳米多孔金上负载对Hcy特异性的酶，达到特异性的检测Hcy目的利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法还未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法。本专利技术所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法，步骤是：(1)纳米多孔金电极的制备及其表征；其中，所述电极的制备方法是：将厚度为100±10nm的金银合金薄膜置于30±2℃的浓硝酸中，腐蚀30～60min，制得NPG，将制得的NPG贴在玻碳电极表面，并在NPG表面滴加2～5μL0.05％的Nafion，待晾干后，用红外灯烘烤10min，制得纳米多孔金电极NPG/GCE；(2)酶修饰电极的制备；(3)以蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)产生的电流响应值，做出同型半胱氨酸(Hcy)线性标准曲线；(4)用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测含同型半胱氨酸(Hcy)的尿液稀释样品；其特征在于：步骤(1)所述纳米多孔金电极表征的方法是：以制得纳米多孔金电极NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5MH2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位范围为+0.3～+0.4V，扫描高电位范围为+1.5～+1.6V，以NPG/GCE电极表面氧化物形成的电量表征NPG/GCE电极的有效面积；步骤(2)所述酶修饰电极的制备方法是：将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2±1mgmL-1的蛋氨酸裂解酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得蛋氨酸裂解酶修饰电极；或者将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2±1mgmL-1的胱硫醚合成酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得胱硫醚合成酶修饰电极；步骤(3)所述以蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度Hcy产生的电流响应值，做出Hcy线性标准曲线的方法是：在50mM，pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中分别加入5μM、10μM、30μM、50μM、100μM的同型半胱氨酸，采用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极，利用时间电流法检测，测试电位范围为-0.2～0.0V，检测时间为150～300s，电流响应值取电流稳定后的电流值；将检测得到的电流响应值对Hcy的浓度作图，分别得到两种酶修饰电极检测Hcy的线性标准曲线；步骤(4)所述用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测含Hcy的尿液稀释样品的方法是：取尿液样品，用50mM、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液和尿液样品以9:1的配比体积混合成尿液稀释样品，在尿液稀释样品中加入设定浓度的Hcy，采用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极，利用时间电流法检测并验证测试结果；测试电位范围为-0.2～0.0V，检测时间范围为150～300s，电流响应值取电流稳定后的电流值，将得到的电流响应值代入Hcy线性标准曲线中即可得到尿液稀释样品中Hcy的浓度；验证结果显示得到的同型半胱氨酸浓度与加入的同型半胱氨酸浓度值相比离差率均小于5％，证明利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法可行。上述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法中，步骤(1)所述纳米多孔金电极表征方法优选是：以制得纳米多孔金电极NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5MH2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位为+0.35V，扫描高电位为+1.55V，以纳米多孔金电极表面氧化物形成的电量表征纳米多孔金电极NPG/GCE的有效面积。上述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法中，步骤(2)所述酶修饰电极的制备方法优选是：将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2mgmL-1的蛋氨酸裂解酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得蛋氨酸裂解酶修饰电极；或者将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2mgmL-1的胱硫醚合成酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得胱硫醚合成酶修饰电极。上述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法中，步骤(3)所述测试电位优选-0.1V，检测时间为200s。上述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法中，步骤(4)所述测试电位优选-0.1V，检测时间为200s。本专利技术提供了一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸(Hcy)的方法，是基于酶和NPG协同催化Hcy实现对Hcy检测，其关键原理在于蛋氨酸裂解酶可催化Hcy产生硫化氢、氨气和α-丁酮酸，NPG可催化硫化氢生成硫单质和多硫化物，这一过程伴随电子的转移，产生电流信号，利用蛋氨酸裂解酶修饰电极检测到的电流响应值，即可对应不同浓度的Hcy；胱硫醚合成酶可催化一分子的同型半胱氨酸和一分子的半胱氨酸产生硫化氢和胱硫醚，NPG可催化硫化氢生成硫单质和多硫化物，这一过程伴随电子的转移，产生电流信号，利用胱硫醚合成酶修饰电极检测到的电流响应值，即可对应不同浓度的Hcy。因此，分别利用构建的两种酶修饰电本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法，步骤是：/n(1)纳米多孔金电极的制备及其表征；/n其中，所述电极的制备方法是：将厚度为100±10nm的金银合金薄膜置于30±2℃的浓硝酸中，腐蚀30～60min，制得NPG，将制得的NPG贴在玻碳电极表面，并在NPG表面滴加2～5μL 0.05％的Nafion，待晾干后，用红外灯烘烤10min，制得纳米多孔金电极NPG/GCE；/n(2)酶修饰电极的制备；/n(3)以蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度同型半胱氨酸产生的电流响应值，做出同型半胱氨酸线性标准曲线；/n(4)用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测含同型半胱氨酸的尿液稀释样品；/n其特征在于：/n步骤(1)所述纳米多孔金电极表征的方法是：/n以制得纳米多孔金电极NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5M H

【技术特征摘要】
1.一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法，步骤是：
(1)纳米多孔金电极的制备及其表征；
其中，所述电极的制备方法是：将厚度为100±10nm的金银合金薄膜置于30±2℃的浓硝酸中，腐蚀30～60min，制得NPG，将制得的NPG贴在玻碳电极表面，并在NPG表面滴加2～5μL0.05％的Nafion，待晾干后，用红外灯烘烤10min，制得纳米多孔金电极NPG/GCE；
(2)酶修饰电极的制备；
(3)以蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度同型半胱氨酸产生的电流响应值，做出同型半胱氨酸线性标准曲线；
(4)用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测含同型半胱氨酸的尿液稀释样品；
其特征在于：
步骤(1)所述纳米多孔金电极表征的方法是：
以制得纳米多孔金电极NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5MH2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位范围为+0.3～+0.4V，扫描高电位范围为+1.5～+1.6V，以NPG/GCE电极表面氧化物形成的电量表征NPG/GCE电极的有效面积；
步骤(2)所述酶修饰电极的制备方法是：
将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2±1mgmL-1的蛋氨酸裂解酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得蛋氨酸裂解酶修饰电极；或者将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2±1mgmL-1的胱硫醚合成酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得胱硫醚合成酶修饰电极；
步骤(3)所述以蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度同型半胱氨酸产生的电流响应值，做出同型半胱氨酸线性标准曲线的方法是：
在50mM，pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中分别加入5μM、10μM、30μM、50μM、100μM的同型半胱氨酸，采用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极，利用时间电流法检测，测试电位范围为-0.2～0.0V，检测时间为150～300s，电流响应值取电流稳定后的电流值；将检测得到的电流响应值对同型半胱氨酸的浓度作图，分别得到两种酶修饰电极检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：王霞，高岩，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37