检测耳聋基因SLC26A4点突变的引物及其应用制造技术

本发明专利技术属于医疗检测领域，具体涉及检测耳聋基因SLC26A4点突变的引物及其应用，本发明专利技术创造性的在耳聋基因位点2162引入LNA核苷单体修饰技术，结合多重PCR技术、单碱基延伸技术与飞行时间质谱技术实现对耳聋基因位点2162的高灵敏特异性检测，此外，本发明专利技术还公开了耳聋基因多位点检测试剂盒，可以同时检测多个耳聋基因的热点突变，延伸效率高、诊断快速、操作简单、成本低，本发明专利技术为耳聋基因临床检测提供了参考。

【技术实现步骤摘要】
检测耳聋基因SLC26A4点突变的引物及其应用
本专利技术属于医疗检测领域，具体涉及检测耳聋基因SLC26A4点突变的引物及其应用
技术介绍
耳聋是是临床上最常见的遗传病之一，目前耳聋筛查普遍采用的是传统的物理学听力缺陷筛查方法，存在着确诊时间过长(2年)和漏检(尤其是迟发性耳聋)的缺陷，从而造成耳聋悲剧的不断发生。耳聋的基因检测能够将耳聋的发生由传统的被动治疗转向主动预防，做到早发现、早干预，从而避免耳聋的发生，因此耳聋易感基因检测有非常重要的意义。目前市面上的基因检测方法众多，例如：荧光定量PCR、测序和质谱检测等，荧光定量PCR因其检测速度较快、灵敏度较高而应用较广，但其通量有限，无法方便快捷地满足临床对于多基因的数十个至数百个位点检测的需求，若要提高检测通量势必增加成本和检测时间，无形之中限制了其发展；高通量测序弥补了荧光定量PCR基因检测通量有限的问题，能够实现超高通量检测，但其成本高，耗时长且对操作人员需求较高，不适用于常规检测。而质谱技术作为一种高精度的分析技术，已受到广泛关注。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)是质谱技术的一个分支，其打破了以往质谱仅可进行小分子物质分析的传统，使得核酸、蛋白质等生物大分子也可应用质谱进行研究，极大推进了基因组学、蛋白质组学的发展，给生物及医学领域带来了革命性的突破。MALDI-TOFMS可以实现对生物大分子物质分子量的测定、对蛋白质进行高通量的鉴定，对有机小分子化合物分子量的测定，对寡核苷酸的分析，对临床微生物的鉴定以及对基因的单核苷酸多态性的分析。单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，且这些变异在人群中所占比例＞1％。单核苷酸多态性在遗传疾病的诊断和筛查，用药种类及剂量指导等方面有着极其重要的作用。随着人们对疾病机制和治疗手段不断深入的研究，临床对SNP检测的需求正在从单基因的有限几个位点逐步转移至多基因多位点。MALDI-TOFMS利用多重PCR技术，即1个反应管可同时检测多个SNP位点，可极大的提高多基因多位点的检测效率以及降低样本用量，满足临床新的需求。目前质谱平台上开发的遗传性耳聋基因检测项目，为了防止二价电子干扰，多重扩增引物干扰，且结合电信号特征，核酸质谱检测的区间通常只能在4500Da-9000Da之间，这就将单碱基延伸引物的长度限制在15-29bp之间。根据单碱基延伸引物设计的原理，它的3’端碱基紧挨SNP检测位点，因此单碱基引物的结构受到检测位点的限制。若检测位点附近GC含量过低，Tm值低，单碱基延伸引物结合到模板的能力变差，特异性变差，延伸反应受到抑制。对于部分检测位点如SLC26A4基因上的2162C＞T，该位点5’GC含量低，在质谱检测范围内(4500Da-9000Da)设计的单碱基延伸引物退火温度低于48℃，延伸效率低，从而降低该位点检测的灵敏度；而3’端与检测位点2168A＞G紧邻，若在3’端设计引物将干扰其他位点检出。
技术实现思路
为了解决质谱法检测SNP位点时，由于序列特征导致延伸引物工作效率低，影响检出灵敏度的问题，公开了：一种检测耳聋基因SLC26A4点突变的引物，所述检测SNP位点为2162C＞T，所述引物包括单碱基延伸引物，单碱基延伸引物序列如SEQIDNO.1所示，所述单碱基延伸引物在5’端有锁核酸修饰。优选的，所述锁核酸从5’端间隔修饰在所述单碱基延伸引物上。优选的，所述单碱基延伸引物上有3-6个锁核酸修饰。优选的，所述单碱基延伸引物上有3个锁核酸修饰。优选的，所述引物还包括PCR扩增引物，所述PCR扩增引物序列如SEQIDNO.35～36所示。另一方面，本专利技术还公开了所述的引物在制备检测耳聋基因多态性产品中的应用。另一方面，本专利技术还公开了一种检测耳聋基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物。优选的，所述试剂盒还包括检测耳聋基因GJB2、GJB3和/或12SrRNA的SNP位点的引物。优选的，所述SNP位点包括：GJB2基因上的rs80338943(235delC)、rs750188782(176_191del16、rs111033204(299300delAT)、rs80338939(35delG)，GJB3基因上的rs74315318(547G＞A)和rs74315319(538C＞T)，SLC26A4基因上的rs111033220(1229C＞T)、rs201562855(1174A＞T)、rs111033305(1226G＞A)、rs200455203(1975G＞C)、rs111033318(2027T＞A)、rs121908363(2162C＞T)、rs121908362(2168A＞G)、rs1057516953(281C＞T)、rs111033380(589G＞A)、rs192366176(IVS15+5G＞A)、rs111033313(IVS7-2A＞G)，12SrRNA基因上的rs267606617(1555A＞G)、rs267606619(1494C＞T)和rs267606618(1095T＞C)中的一种或多种。上述“rs+编号”代表的是括号中的突变位点，rs是突变位点的公认的唯一的标号，在说明书中标明，便于查询。优选的，针对上述SNP位点的引物序列如SEQIDNO.15～36所示。其中，多重PCR引物序列为核心序列，其在5’端可包括5-15个保护碱基序列，其通过增大核心引物的分子量，避免反应剩余的多重PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果；其中该保护碱基序列为10bp的tag：ACGTTGGATG。本专利技术所述“单碱基延伸”是指：反应时单碱基延伸引物延伸一个碱基即终止，经质谱仪检测后，根据峰的移动位置确定该单碱基延伸产物后掺入的碱基种类，从而得知对应的SNP类型。本专利技术所述“锁核酸”为一种双环状核酸衍生物，核糖的2’-O位和4’-C位通过缩水作用形成氧亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。锁核酸(LNA)具有序列特异性，它比常规的核酸能更好地区分正确配对和错误配对序列，含有错配碱基的LNA-DNA杂交分子比含有错配碱基的DNA-DNA杂交分子更加不稳定，在LNA-DNA双螺旋中的一个错配碱基至少使Tm值下降20℃，而在相应的DNA-DNA双螺旋中，一个错配碱基使Tm值下降4-16℃。有益效果：本专利技术创造性的在耳聋基因位点2162引入LNA核苷单体修饰技术，结合多重PCR技术、单碱基延伸技术与飞行时间质谱技术实现对耳聋基因位点2162的高灵敏特异性检测，此外，本专利技术还公开了耳聋基因多位点检测试剂盒，因为改进了位点2162的扩增速率，可以同时高效的检测多个耳聋基因的热点突变，延伸效率高、诊断快速、操作简单、成本低。附图说明图1：SEQ-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测耳聋基因SLC26A4点突变的引物，检测SNP位点为2162C＞T，其特征在于，所述引物包括单碱基延伸引物，单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述单碱基延伸引物在5’端有锁核酸修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测耳聋基因SLC26A4点突变的引物，检测SNP位点为2162C＞T，其特征在于，所述引物包括单碱基延伸引物，单碱基延伸引物序列如SEQIDNO.1所示，所述单碱基延伸引物在5’端有锁核酸修饰。


2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述锁核酸从5’端间隔修饰在所述单碱基延伸引物上。


3.如权利要求1或2所述的引物，其特征在于，所述单碱基延伸引物上有3-6个锁核酸修饰。


4.如权利要求3所述的引物，其特征在于，所述单碱基延伸引物上有3个锁核酸修饰。


5.如权利要求1或2所述的引物，其特征在于，所述引物还包括PCR扩增引物，所述PCR扩增引物序列如SEQIDNO.35～36所示。


6.如权利要求1或2所述的引物在制备检测耳聋基因多态性产品中的应用。


7.一种检测耳聋基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶彬彬，
申请(专利权)人：重庆中元汇吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50