一种TIL细胞的活化方法技术

本发明专利技术公开一种TIL细胞的活化方法，包括以下步骤：将TIL细胞用培养液悬浮培养，培养时首先加入绞股蓝皂苷和促活性小肽，至少一天后加入山莨菪碱和细胞因子；之后用含有细胞因子的培养液换液；所述促活性小肽的氨基酸序列为Ala‑Gly‑Glu‑Arg‑Asp‑Met。采用本发明专利技术方法，TIL细胞培养至第5d时，其杀伤活性明显增强，第7天时，达到活性峰值。

【技术实现步骤摘要】
一种TIL细胞的活化方法
本专利技术属于生物医学领域，涉及细胞的活化方法，具体涉及一种TIL细胞的活化方法。
技术介绍
TIL细胞(Tumorinfiltratinglymphocyte)即肿瘤浸润淋巴细胞，是从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞，是继LAK之后的新型抗肿瘤效应细胞，其抗肿瘤效果是LAK至少50倍，已应用于临床治疗皮肤、肾、肺、肝、卵巢的原发或继发肿瘤。TIL细胞具有高效、特异、副作用小等优点，已经成为国内外恶性肿瘤生物治疗的热点之一。新鲜分离的TIL抗肿瘤活性低下，而经过IL-2等细胞因子体外培养或体内激活，TIL的活性得到提高，然而遗憾的是TIL的活化培养时间较长，大量研究显示，TIL细胞的活性在培养第14～21d时才能达到峰值。例如《细胞因子诱导的杀伤细胞与肿瘤浸润淋巴细胞体外细胞毒活性比较》(蒋敬庭等)用含10％AB型血清、4.0×105U/LIL-2的RPMI1640培养液调整细胞浓度为2.0×106/mL，置温箱中培养。其对比了CIK细胞和TIL细胞对K562细胞的细胞毒活性，结果显示CIK细胞对K562细胞的细胞毒活性在14d时达峰值，而TIL细胞在21d时才达峰值。因此，活化培养时间过长，使TIL细胞的临床应用受到限制。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种TIL细胞的活化方法。本专利技术方案包括以下内容：一种TIL细胞的活化方法，包括以下步骤：将TIL细胞用培养液悬浮培养，培养时首先加入绞股蓝皂苷和促活性小肽，至少一天后加入山莨菪碱和细胞因子；之后用含有细胞因子的培养液换液；所述促活性小肽的氨基酸序列为Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met。该小肽由常规方法人工合成。优选的，绞股蓝皂苷添加的终浓度为5～8mg/mL。优选的，促活性小肽添加的终浓度为0.1～1.0mg/mL。优选的，山莨菪碱添加的终浓度为1～5mg/mL。优选的，所述细胞因子包括IL-2、IL-4。优选的，所述培养液为含有血清的RPMI-1640培养液，所述血清包括新生牛血清、人AB型血清。优选的，所述的TIL细胞的活化方法，包括以下步骤：将TIL细胞用培养液培养，培养的第1天加入终浓度为5～8mg/mL绞股蓝皂苷和0.1～1.0mg/mL促活性小肽；第2天加入终浓度1～5mg/mL的山莨菪碱和60～80U/mL的IL-2，以后每隔1～2d采用含有终浓度400～1000U/mLIL-2的培养液换液。本专利技术所取得的有益效果：本专利技术首先发现绞股蓝皂苷、促活性小肽Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met、山莨菪碱有利于新分离TIL细胞免疫抑制的解除，在此基础上经研究确定，促活性小肽在绞股蓝皂的作用下才能改善细胞的代谢功能，提前添加山莨菪碱不利于TIL细胞活性的释放。因此应首先添加促活性小肽和绞股蓝皂，再添加山莨菪碱和细胞因子。采用本专利技术方法，TIL细胞培养至第5d时，其杀伤活性明显增强，第7天时，达到活性峰值。采用该方法培养5d即可得到增殖倍数175以上，杀伤率达到85％以上，培养5d后即可用于临床治疗，满足临床治疗的需求。具体实施方式为了更好理解本专利技术
技术实现思路
，下面提供具体实施例，对本专利技术做进一步的说明。实施例1：TIL细胞的分离实验方法：1)将肝癌组织剪碎至约1mm3小块，置于3600UDNA酶、60μg胶原酶和125U透明质酸酶的RPMI-1640培养液中，混匀并于37℃恒温搅拌1h。2)将酶消化后的细胞悬液经200目滤网过滤，以除去未消化的肿瘤组织块。1500rpm离心5min收集单个细胞，用RPMI-1640培养液洗细胞，将细胞再悬浮。3)梯度离心分离TIL细胞：于离心管内分层放入100％及75％的淋巴细胞分离液各15mL，再缓慢从管壁加入20mL细胞悬液，2000rpm离心20min，收集100％分离液界面上的TIL细胞，再用RPMI-1640培养液洗TIL细胞，以除去细胞分离液，得TIL细胞。实施例2：新分离TIL细胞的活化培养方法以下为研究过程中涉及的4种培养方式：方法1：常规方法，将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清、1000U/mLIL-2的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。每隔2d换液一次。第5、7、9、14天测定TIL细胞对HepG2的杀瘤效应。方法2：将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清、5mg/mL人参皂苷、1.0mg/mL促活性小肽Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met、1mg/mL的山莨菪碱、1000U/mL的IL-2的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。每隔2d换液一次。第5、7、9、14天测定TIL细胞对HepG2的杀瘤效应。方法3：将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清、5mg/mL绞股蓝皂苷、1.0mg/mL促活性小肽Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met、1mg/mL的山莨菪碱、1000U/mL的IL-2的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。每隔2d换液一次。第5、7、9、14天测定TIL细胞对HepG2的杀瘤效应。方法4：将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。培养的第1天加入终浓度为1mg/mL的山莨菪碱和1.0mg/mL促活性小肽(Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met)；第2天加入终浓度5mg/mL绞股蓝皂苷和1000U/mL的IL-2，以后每隔2d采用含有终浓度1000U/mLIL-2的培养液换液。培养的第5、7、9、14天测定TIL细胞对HepG2的杀瘤效应。方法5：将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。培养的第1天加入终浓度为5mg/mL绞股蓝皂苷和1.0mg/mL促活性小肽(Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met)；第2天加入终浓度1mg/mL的山莨菪碱和1000U/mL的IL-2，以后每隔2d采用含有终浓度1000U/mLIL-2的培养液换液。培养的第5、7、9、14天测定TIL细胞对HepG2的杀瘤效应。方法6：将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。培养的第1天加入终浓度为5mg/mL绞股蓝皂苷和1.0mg/mL促活性小肽(Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met)；第2天加入终浓度1mg/mL的山莨菪碱和60U/mL的IL-2，以后每隔2d采用含有终浓度1000U/mLIL-2的培养液换液。培养的第5、7、9、14天测定TIL细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种TIL细胞的活化方法，其特征在于，包括以下步骤：将TIL细胞用培养液悬浮培养，培养时首先加入绞股蓝皂苷和促活性小肽，至少一天后加入山莨菪碱和细胞因子；之后用含有细胞因子的培养液换液；/n所述促活性小肽的氨基酸序列为Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met。/n

【技术特征摘要】
1.一种TIL细胞的活化方法，其特征在于，包括以下步骤：将TIL细胞用培养液悬浮培养，培养时首先加入绞股蓝皂苷和促活性小肽，至少一天后加入山莨菪碱和细胞因子；之后用含有细胞因子的培养液换液；
所述促活性小肽的氨基酸序列为Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met。


2.根据权利要求1所述的TIL细胞的活化方法，其特征在于，绞股蓝皂苷添加的终浓度为5～8mg/mL。


3.根据权利要求1所述的TIL细胞的活化方法，其特征在于，促活性小肽添加的终浓度为0.1～1.0mg/mL。


4.根据权利要求1所述的TIL细胞的活化方法，其特征在于，山莨菪碱添加的终浓度为1～5mg/mL。...

【专利技术属性】
技术研发人员：湛振键，彭大为，刘世豪，
申请(专利权)人：广东康盾创新产业集团股份公司，
类型：发明
国别省市：广东;44