一种用于鉴定莴苣杂交种真实性的方法及其使用的KASP引物组合技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定莴苣杂交种真实性的方法及其使用的KASP引物组合。该方法包括如下步骤：分别检测待测莴苣和32个莴苣杂交种基于18个SNP位点的基因型，然后进行如下判断：如果待测莴苣基于所述18个SNP位点的基因型和32个莴苣杂交种中某品种完全一致，则待测莴苣与该莴苣品种属于同一个品种。本发明专利技术使得辨别莴苣杂交种真伪的操作变得准确便捷。本发明专利技术提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等优点，且不易受到环境影响，具有十分广阔的应用前景。本发明专利技术具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定莴苣杂交种真实性的方法及其使用的KASP引物组合
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于鉴定莴苣杂交种真实性的方法及其使用的KASP引物组合。
技术介绍
莴苣(LactucasativaL.)起源于欧洲地中海沿岸和西亚一带，由野生种驯化而来。叶用莴苣(生菜)是莴苣的栽培变种，是全球范围内种植面积最广泛的蔬菜之一，也是产量最大的蔬菜之一。莴苣花为舌状花、花小，柱头包裹在花药里面，1朵花由20多朵舌状小花组成。莴苣的花无法在蕾期去雄，只能在开花期进行去雄，但是开花时间很短，这就给真杂种的获得带来不便。目前国内莴苣主要是常规种，受利益的驱动，以常规种(或亲本)冒充杂交种或不同的自交系混杂冒充杂交种等掺杂使假现象时有发生。依据形态性状进行莴苣杂交种田间鉴定的传统手段时效性差，且容易受到环境与主观因素的影响。以DNA为基础的分子标记具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点。目前主流的分子标记是SSR(Simplesequencerepeats)和SNP(Singlenucleotidepolymorphism)标记。SSR是第二代分子标记，具有多态性高、呈共显性、易于操作、成本低等优点。基于SSR标记在品种指纹图谱构建、纯度鉴定与遗传多样性分析等方面的研究已有大量报道，但在实践中，SSR也暴露出检测位点较少、数据量少、结果代表性较差、不易实现数据共享等难以克服的缺陷。SNP是指基因组核苷酸序列中由单个核苷酸水平上的变异而引起的基因组水平上的DNA序列多态性，主要包括单个碱基的缺失、插入、转换及颠换等。基于SNP位点设计的标记即为在此基础上发展起来的第三代分子标记，该标记类型具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点，在纯系鉴定及分子辅助单株选择等方面具有优势。SNP标记作为第3代分子标记，与SSR标记相比具有以下优势：一是在基因组中密度更高分布更均匀；二是更适合数据库整合和数据共享；三是检测位点数量远远高于SSR；四是与功能基因甚至植物表型关联度高。SNP标记目前被公认是极具应用前景的分子标记技术。SNP位点有基于测序、芯片及PCR等各种平台的检测方法。其中，KASP(KompetitiveallelespecificPCR，即竞争性等位基因特异性PCR)技术是基于引物末端碱基的特异匹配对SNP分型，可在广泛的基因组DNA样品中对SNP位点进行精准的双等位基因判断，具有高度稳定性与准确性。与第二代分子标记相比，KASP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法。因此，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。开发适合于高通量分子检测平台的莴苣杂交种KASP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国莴苣的杂交育种效率和育种水平具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是鉴定莴苣品种(尤其是41个莴苣品种)和莴苣杂交种(尤其是32个莴苣杂交种)。本专利技术首先保护引物组合，可包括用于扩增Sol_KASP01位点的引物组1、用于扩增Sol_KASP02位点的引物组2、用于扩增Sol_KASP03位点的引物组3、用于扩增Sol_KASP04位点的引物组4、用于扩增Sol_KASP05位点的引物组5、用于扩增Sol_KASP06位点的引物组6、用于扩增Sol_KASP07位点的引物组7、用于扩增Sol_KASP08位点的引物组8、用于扩增Sol_KASP09位点的引物组9、用于扩增Sol_KASP10位点的引物组10、用于扩增Sol_KASP11位点的引物组11、用于扩增Sol_KASP12位点的引物组12、用于扩增Sol_KASP13位点的引物组13、用于扩增Sol_KASP14位点的引物组14、用于扩增Sol_KASP15位点的引物组15、用于扩增Sol_KASP16位点的引物组16、用于扩增Sol_KASP17位点的引物组17和用于扩增Sol_KASP18位点的引物组18。所述Sol_KASP01位点—所述Sol_KASP18位点可为莴苣基因组的18个SNP位点。所述Sol_KASP01位点为1号染色体上的第126697665位核苷酸。所述Sol_KASP02位点为1号染色体上的第147985160位核苷酸。所述Sol_KASP03位点为2号染色体上的第122143189位核苷酸。所述Sol_KASP04位点为2号染色体上的第210259848位核苷酸。所述Sol_KASP05位点为3号染色体上的第27187844位核苷酸。所述Sol_KASP06位点为3号染色体上的第212222861位核苷酸。所述Sol_KASP07位点为3号染色体上的第247666277位核苷酸。所述Sol_KASP08位点为4号染色体上的第215625068位核苷酸。所述Sol_KASP09位点为4号染色体上的第340636295位核苷酸。所述Sol_KASP10位点为5号染色体上的第313574466位核苷酸。所述Sol_KASP11位点为6号染色体上的第88254911位核苷酸。所述Sol_KASP12位点为7号染色体上的第210730056位核苷酸。所述Sol_KASP13位点为7号染色体上的第89707923位核苷酸。所述Sol_KASP14位点为7号染色体上的第103614221位核苷酸。所述Sol_KASP15位点为8号染色体上的第215217745位核苷酸。所述Sol_KASP16位点为8号染色体上的第240162601位核苷酸。所述Sol_KASP17位点为9号染色体上的第84172204位核苷酸。所述Sol_KASP18位点为9号染色体上的第173010178位核苷酸。所述引物组合中，所述引物组1可由SEQIDNO:1所示的正向引物01F1、SEQIDNO:2所示的正向引物01F2和SEQIDNO:3所示的反向引物01R组成。所述引物组2可由SEQIDNO:4所示的正向引物02F1、SEQIDNO:5所示的正向引物02F2和SEQIDNO:6所示的反向引物02R组成。所述引物组3可由SEQIDNO:7所示的正向引物03F1、SEQIDNO:8所示的正向引物03F2和SEQIDNO:9所示的反向引物03R组成。所述引物组4可由SEQIDNO:10所示的正向引物04F1、SEQIDNO:11所示的正向引物04F2和SEQIDNO:12所示的反向引物04R组成。所述引物组5可由SEQIDNO:13所示的正向引物05F1、SEQIDNO:14所示的正向引物05F2和SEQIDNO:15所示的反向引物05R组成。所述引物组6可由SEQIDNO:16所示的正向引物06F1、SEQIDNO:17所示的正向引物06F2和SEQIDNO:18所示的反向引物06R组成。所述引物组7可由SEQIDNO:19所示的正向引物07F1、SEQIDNO:20所示的正向引物07F本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组合，包括/n用于扩增Sol_KASP01位点的引物组1、/n用于扩增Sol_KASP02位点的引物组2、/n用于扩增Sol_KASP03位点的引物组3、/n用于扩增Sol_KASP04位点的引物组4、/n用于扩增Sol_KASP05位点的引物组5、/n用于扩增Sol_KASP06位点的引物组6、/n用于扩增Sol_KASP07位点的引物组7、/n用于扩增Sol_KASP08位点的引物组8、/n用于扩增Sol_KASP09位点的引物组9、/n用于扩增Sol_KASP10位点的引物组10、/n用于扩增Sol_KASP11位点的引物组11、/n用于扩增Sol_KASP12位点的引物组12、/n用于扩增Sol_KASP13位点的引物组13、/n用于扩增Sol_KASP14位点的引物组14、/n用于扩增Sol_KASP15位点的引物组15、/n用于扩增Sol_KASP16位点的引物组16、/n用于扩增Sol_KASP17位点的引物组17和/n用于扩增Sol_KASP18位点的引物组18；/nSol_KASP01位点—Sol_KASP18位点为莴苣基因组的18个SNP位点；/nSol_KASP01位点为1号染色体上的第126697665位核苷酸；/nSol_KASP02位点为1号染色体上的第147985160位核苷酸；/nSol_KASP03位点为2号染色体上的第122143189位核苷酸；/nSol_KASP04位点为2号染色体上的第210259848位核苷酸；/nSol_KASP05位点为3号染色体上的第27187844位核苷酸；/nSol_KASP06位点为3号染色体上的第212222861位核苷酸；/nSol_KASP07位点为3号染色体上的第247666277位核苷酸；/nSol_KASP08位点为4号染色体上的第215625068位核苷酸；/nSol_KASP09位点为4号染色体上的第340636295位核苷酸；/nSol_KASP10位点为5号染色体上的第313574466位核苷酸；/nSol_KASP11位点为6号染色体上的第88254911位核苷酸；/nSol_KASP12位点为7号染色体上的第210730056位核苷酸；/nSol_KASP13位点为7号染色体上的第89707923位核苷酸；/nSol_KASP14位点为7号染色体上的第103614221位核苷酸；/nSol_KASP15位点为8号染色体上的第215217745位核苷酸；/nSol_KASP16位点为8号染色体上的第240162601位核苷酸；/nSol_KASP17位点为9号染色体上的第84172204位核苷酸；/nSol_KASP18位点为9号染色体上的第173010178位核苷酸。/n...

【技术特征摘要】
1.引物组合，包括
用于扩增Sol_KASP01位点的引物组1、
用于扩增Sol_KASP02位点的引物组2、
用于扩增Sol_KASP03位点的引物组3、
用于扩增Sol_KASP04位点的引物组4、
用于扩增Sol_KASP05位点的引物组5、
用于扩增Sol_KASP06位点的引物组6、
用于扩增Sol_KASP07位点的引物组7、
用于扩增Sol_KASP08位点的引物组8、
用于扩增Sol_KASP09位点的引物组9、
用于扩增Sol_KASP10位点的引物组10、
用于扩增Sol_KASP11位点的引物组11、
用于扩增Sol_KASP12位点的引物组12、
用于扩增Sol_KASP13位点的引物组13、
用于扩增Sol_KASP14位点的引物组14、
用于扩增Sol_KASP15位点的引物组15、
用于扩增Sol_KASP16位点的引物组16、
用于扩增Sol_KASP17位点的引物组17和
用于扩增Sol_KASP18位点的引物组18；
Sol_KASP01位点—Sol_KASP18位点为莴苣基因组的18个SNP位点；
Sol_KASP01位点为1号染色体上的第126697665位核苷酸；
Sol_KASP02位点为1号染色体上的第147985160位核苷酸；
Sol_KASP03位点为2号染色体上的第122143189位核苷酸；
Sol_KASP04位点为2号染色体上的第210259848位核苷酸；
Sol_KASP05位点为3号染色体上的第27187844位核苷酸；
Sol_KASP06位点为3号染色体上的第212222861位核苷酸；
Sol_KASP07位点为3号染色体上的第247666277位核苷酸；
Sol_KASP08位点为4号染色体上的第215625068位核苷酸；
Sol_KASP09位点为4号染色体上的第340636295位核苷酸；
Sol_KASP10位点为5号染色体上的第313574466位核苷酸；
Sol_KASP11位点为6号染色体上的第88254911位核苷酸；
Sol_KASP12位点为7号染色体上的第210730056位核苷酸；
Sol_KASP13位点为7号染色体上的第89707923位核苷酸；
Sol_KASP14位点为7号染色体上的第103614221位核苷酸；
Sol_KASP15位点为8号染色体上的第215217745位核苷酸；
Sol_KASP16位点为8号染色体上的第240162601位核苷酸；
Sol_KASP17位点为9号染色体上的第84172204位核苷酸；
Sol_KASP18位点为9号染色体上的第173010178位核苷酸。


2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：
所述引物组1由SEQIDNO:1所示的正向引物01F1、SEQIDNO:2所示的正向引物01F2和SEQIDNO:3所示的反向引物01R组成；
所述引物组2由SEQIDNO:4所示的正向引物02F1、SEQIDNO:5所示的正向引物02F2和SEQIDNO:6所示的反向引物02R组成；
所述引物组3由SEQIDNO:7所示的正向引物03F1、SEQIDNO:8所示的正向引物03F2和SEQIDNO:9所示的反向引物03R组成；
所述引物组4由SEQIDNO:10所示的正向引物04F1、SEQIDNO:11所示的正向引物04F2和SEQIDNO:12所示的反向引物04R组成；
所述引物组5由SEQIDNO:13所示的正向引物05F1、SEQIDNO:14所示的正向引物05F2和SEQIDNO:15所示的反向引物05R组成；
所述引物组6由SEQIDNO:16所示的正向引物06F1、SEQIDNO:17所示的正向引物06F2和SEQIDNO:18所示的反向引物06R组成；
所述引物组7由SEQIDNO:19所示的正向引物07F1、SEQIDNO:20所示的正向引物07F2和SEQIDNO:21所示的反向引物07R组成；
所述引物组8由SEQIDNO:22所示的正向引物08F1、SEQIDNO:23所示的正向引物08F2和SEQIDNO:24所示的反向引物08R组成；
所述引物组9由SEQIDNO:25所示的正向引物09F1、SEQIDNO:26所示的正向引物09F2和SEQIDNO:27所示的反向引物09R组成；
所述引物组10由SEQIDNO:28所示的正向引物10F1、SEQIDNO:29所示的正向引物10F2和SEQIDNO:30所示的反向引物10R组成；
所述引物组11由SEQIDNO:31所示的正向引物11F1、SEQIDNO:32所示的正向引物11F2和SEQIDNO:33所示的反向引物11R组成；
所述引物组12由SEQIDNO:34所示的正向引物12F1、SEQIDNO:35所示的正向引物12F2和SEQIDNO:36所示的反向引物12R组成；
所述引物组13由SEQIDNO:37所示的正向引物13F1、SEQIDNO:38所示的正向引物13F2和SEQIDNO:39所示的反向引物13R组成；
所述引物组14由SEQIDNO:40所示的正向引物14F1、SEQIDNO:41所示的正向引物14F2和SEQIDNO:42所示的反向引物14R组成；
所述引物组15由SEQIDNO:43所示的正向引物15F1、SEQIDNO:44所示的正向引物15F2和SEQIDNO:45所示的反向引物15R组成；
所述引物组16由SEQIDNO:46所示的正向引物16F1、SEQIDNO:47所示的正向引物16F2和SEQIDNO:32所示的反向引物16R组成；
所述引物组17由SEQIDNO:49所示的正向引物17F1、SEQIDNO:50所示的正向引物17F2和SEQIDNO:51所示的反向引物17R组成；
所述引物组18由SEQIDNO:52所示的正向引物18F1、SEQIDNO:53所示的正向引物18F2和SEQIDNO:54所示的反向引物18R组成。


3.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：
所述引物组1由SEQIDNO:1自5’末端起第22至45位所示的正向引物01F1、SEQIDNO:2自5’末端起第22至45位所示的正向引物01F2和SEQIDNO:3所示的反向引物01R组成；
所述引物组2由SEQIDNO:4自5’末端起第22至45位所示的正向引物02F1、SEQIDNO:5自5’末端起第22至44位所示的正向引物02F2和SEQIDNO:6所示的反向引物02R组成；
所述引物组3由SEQIDNO:7自5’末端起第22至46位所示的正向引物03F1、SEQIDNO:8自5’末端起第22至47位所示的正向引物03F2和SEQIDNO:9所示的反向引物03R组成；
所述引物组4由SEQIDNO:10自5’末端起第22至48位所示的正向引物04F1、SEQIDNO:11自5’末端起第22至48位所示的正向引物04F2和SEQIDNO:12所示的反向引物04R组成；
所述引物组5由SEQIDNO:13自5’末端起第22至43位所示的正向引物05F1、SEQIDNO:14自5’末端起第22至44位所示的正向引物05F2和SEQIDNO:15所示的反向引物05R组成；
所述引物组6由SEQIDNO:16自5’末端起第22至48位所示的正向引物06F1、SEQIDNO:17自5’末端起第22至48位所示的正向引物06F2和SEQIDNO:18所示的反向引物06R组成；
所述引物组7由SEQIDNO:19自5’末端起第22至47位所示的正向引物07F1、SEQIDNO:20自5’末端起第22至47位所示的正向引物07F2和SEQIDNO:21所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨效曾，李波，杨飞，申飞，邓杨，
申请(专利权)人：北京农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11