【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用电泳制备核酸文库相关申请的交叉引用本申请要求2019年7月12日提交的美国临时申请第62/873,603号的优先权的权益,该临时申请中的内容全文以引用方式并入本文以用于任何目的。说明书
本申请涉及使用电泳将核酸分子处理成核酸文库的方法和系统。本申请还涉及使用电泳制备文库的方法、设备和系统。
技术介绍
可以期望由双链核酸靶分子(例如,双链DNA(dsDNA))生成片段化和带标签的核酸(例如,DNA)分子的文库的多种方法和应用。通常,目的是由较大的靶核酸分子生成较小的核酸分子(例如,核酸或DNA片段)以用作测序反应中的模板。当采用大核酸分子时,制备用于测序的文库充满挑战性:在通过多个不同的物理过程(诸如细胞裂解、离心、移液、样本转移和涡旋)来进行过度处理和操作时,大分子易断并且易受损(诸如产生脱碱基位点或切口)。此类损伤导致靶核酸测序产生错误。本文描述了使用电泳执行混合和分离的多个步骤来制备用于测序(例如,片段标签化)的核酸文库的方法,该方法降低了对核酸造成物理损伤的风险。这些方法也可容易地应用于执行其他过程,诸如样本制备、样本提取、生化反应、产物纯化和核酸片段尺寸选择。
技术实现思路
本申请涉及使用凝胶电泳混合和分离用于酶促反应的底物、试剂和产物的方法和设备。本申请还涉及使用凝胶电泳利用转座体复合物将核酸(诸如DNA)片段化和加标签的方法、系统和设备。本文所述的方法、系统和设备涉及使用凝胶电泳利用转座体复合物将DNA片段化和加标签的方法和组合物。本文所示的方法、系 ...
【技术保护点】
1.一种使用电泳执行酶促反应的方法,包括:/n(a)提供电泳系统,所述电泳系统包括:/n电泳凝胶基质,所述电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度;/n第一部分,所述第一部分邻近所述第一端部并且包含酶的第一酶辅因子;/n第二部分,所述第二部分邻近所述第二端部并且包含所述酶的第二酶辅因子,所述第二酶辅因子具有与所述第一酶辅因子的电荷相反的电荷;/n反应部分,所述反应部分在所述第一部分和所述第二部分之间并且包含所述酶;和/n一对正负电极,所述一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处;以及/n(b)在所述一对电极之间施加电场以驱使所述第一酶辅因子从所述第一部分进入所述反应部分并且驱使所述第二酶辅因子从所述第二部分进入所述反应部分,以形成包括所述酶、所述第一酶辅因子和所述第二酶辅因子的活化的酶复合物。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190712 US 62/873,6031.一种使用电泳执行酶促反应的方法,包括:
(a)提供电泳系统,所述电泳系统包括:
电泳凝胶基质,所述电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度;
第一部分,所述第一部分邻近所述第一端部并且包含酶的第一酶辅因子;
第二部分,所述第二部分邻近所述第二端部并且包含所述酶的第二酶辅因子,所述第二酶辅因子具有与所述第一酶辅因子的电荷相反的电荷;
反应部分,所述反应部分在所述第一部分和所述第二部分之间并且包含所述酶;和
一对正负电极,所述一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处;以及
(b)在所述一对电极之间施加电场以驱使所述第一酶辅因子从所述第一部分进入所述反应部分并且驱使所述第二酶辅因子从所述第二部分进入所述反应部分,以形成包括所述酶、所述第一酶辅因子和所述第二酶辅因子的活化的酶复合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中在所述第一酶辅因子为金属离子时,所述第二酶辅因子为多核苷酸。
3.根据权利要求1所述的方法,还包括在步骤(c)之前将用于所述活化的酶复合物的底物施加到所述反应部分,并且其中施加所述电场包括使所述活化的酶复合物与所述反应部分中的所述底物反应以形成反应产物。
4.根据权利要求1所述的方法,其中施加所述电场包括使未反应的第一酶辅因子和第二酶辅因子迁移出所述反应部分,以将所述未反应的第一酶辅因子和第二酶辅因子与所述反应部分中的所述反应产物分离。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一电极为正电极并且所述第一酶辅因子为带正电的,并且所述第二电极为负电极并且所述第二酶辅因子为带负电的。
6.根据权利要求3所述的方法,其中所述底物是靶双链核酸,任选地其中所述靶双链核酸是双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂交体。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述酶是转座酶,任选地其中所述转座酶是Tn5转座酶,并且任选地其中所述第一酶辅因子包括Mg2+,任选地为Mg(OAc)2或MgCl2的形式,并且任选地所述第二酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子。
8.一种由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法,所述方法包括:
(a)提供电泳系统,所述电泳系统包括:
电泳凝胶基质,所述电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度;
第一部分,所述第一部分邻近所述第一端部并且包含第一转座酶辅因子,其中所述第一转座酶辅因子为金属离子;
反应部分,所述反应部分远离所述第一端部并且包含转座体复合物,所述转座体复合物包括转座酶和多核苷酸转座酶衔接子,所述多核苷酸转座酶衔接子包括双链转座子末端序列和单链标签区域;和
一对正负电极,所述一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处;
(b)将靶双链核酸施加到所述反应部分;
(c)在所述一对电极之间施加第一电场以驱使所述第一转座酶辅因子从所述第一部分进入所述反应部分,以形成包括所述转座酶、所述多核苷酸转座酶衔接子和所述第一转座酶辅因子的活化的转座体复合物;以及
(d)在足以片段化所述靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将所述核酸片段加标签的条件下,在所述反应部分中将所述靶双链核酸与所述活化的转座体复合物一起温育,从而产生带标签的核酸片段的文库。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述转座体复合物任选地经由链霉亲和素-生物素相互作用而固定在所述反应部分中的固体载体上。
10.根据权利要求9所述的方法,包括在产生所述带标签的核酸片段后从所述固定载体释放所述转座体复合物。
11.根据权利要求10所述的方法,还包括在驱使与从所述固体载体释放的所述转座体复合物结合的所述带标签的核酸片段进入收集部分的步骤之后改变第一电场的大小。
12.一种由靶双链核酸制备带标签的核酸片段的文库的方法,所述方法包括:
(a)提供电泳系统,所述电泳系统包括:
电泳凝胶基质,所述电泳凝胶基质具有第一端部和第二端部、宽度以及介于所述第一端部和所述第二端部之间的长度;
第一部分,所述第一部分邻近所述第一端部并且包含转座酶的第一转座酶辅因子,其中所述第一转座酶辅因子为金属离子;
第二部分,所述第二部分邻近所述第二端部并且包含所述转座酶的第二转座酶辅因子,所述第二转座酶辅因子具有与所述第一转座酶辅因子的电荷相反的电荷,其中所述第二转座酶辅因子为包括双链转座子末端序列和单链标签区域的多核苷酸转座酶衔接子;
反应部分,所述反应部分在所述第一部分和所述第二部分之间并且包含所述转座酶;和
一对正负电极,所述一对正负电极分别布置在所述第一端部和所述第二端部处;
(b)将靶双链核酸施加到所述反应部分;
(c)在所述一对电极之间施加第一电场以驱使所述第一转座酶辅因子从所述第一部分进入所述反应部分并且驱使所述第二转座酶辅因子从所述第二部分进入所述反应部分,以形成包括所述转座酶、所述第一转座酶辅因子和所述第二转座酶辅因子的活化的转座体复合物;以及
(d)在足以片段化所述靶双链核酸而不是片段化多个核酸片段并且将所述核酸片段加标签的条件下,在所述反应部分中将所述靶双链核酸与所述活化的转座体复合物一起温育,从而产生带标签的核酸片段的文库。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述单链标签区域包括引物序列、条形码序列、唯一分子标识符(UMI)序列、扩增标签、富集标签或纯化标签中的一者或多者。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述转座酶固定在所述反应部分内的固体载体上,任选地其中所述反应部分包括孔,并且所述固体载体是小珠颗粒或者所述孔的表面。
15.根据权利要求12所述的方法,其中将在步骤(c)中施加的所述第一电场设定为所述靶双链核酸在所述电泳基质内基本上不具有电泳迁移率的值。
16.根据权利要求12所述的方法,其中所述电泳系统包括沿所述长度在所述第...
【专利技术属性】
技术研发人员:尼尔·安东尼·戈麦利,
申请(专利权)人:ILLUMINA剑桥有限公司,
类型:发明
国别省市:英国;GB
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