【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用固定在固体载体上的CRISPR/CAS9制备核酸测序文库的组合物和方法相关专利申请的交叉引用本申请要求2019年7月12日提交的美国临时申请62/873,609的优先权权益，该临时申请以引用方式全文并入本文用于任何目的。说明书
本申请涉及使用固定在固体载体上的CRISPR/Cas9酶生成随机片段化双链核酸片段的文库的方法、包含固定CRISPR/Cas9酶的固体载体以及相关组合物。随机片段化双链核酸片段的固定文库可用作例如各种应用(包括例如高通量、大规模平行和/或多重核酸测序)的模板。
技术介绍
有多种方法和应用希望由靶双链核酸靶分子(诸如双链DNA(dsDNA)靶分子)生成随机片段化核酸分子的文库。通常，目的是由较大双链核酸分子生成较小核酸分子(例如核酸片段)以用作核酸测序反应中的模板。目前用于对双链核酸进行片段化和标记以用于下一代测序的许多方法浪费核酸，需要昂贵的仪器来进行片段化，并且用于片段化、标记和回收标记核酸片段的程序很困难、繁琐、费力、费时、低效、昂贵，需要相对大量的样本...
【技术保护点】
1.一种制备随机片段化双链核酸片段的固定文库的方法，包括：/n(a)提供上面固定有CRISPR/Cas9酶的固体载体；以及/n(b)在靶双链核酸被所述CRISPR/Cas9酶随机片段化并且所述CRISPR/Cas9结合所述双链核酸片段的至少一条链的条件下，将所述靶双链核酸施加到所述固体载体；从而产生随机片段化双链核酸片段的固定文库。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190712 US 62/873,6091.一种制备随机片段化双链核酸片段的固定文库的方法，包括：
(a)提供上面固定有CRISPR/Cas9酶的固体载体；以及
(b)在靶双链核酸被所述CRISPR/Cas9酶随机片段化并且所述CRISPR/Cas9结合所述双链核酸片段的至少一条链的条件下，将所述靶双链核酸施加到所述固体载体；从而产生随机片段化双链核酸片段的固定文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶双链核酸包括双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)或双链RNA/DNA杂交体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶双链核酸是dsDNA。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas9酶与第一多核苷酸结合，所述第一多核苷酸指导所述CRISPR/Cas9酶以非序列特异性方式结合所述靶双链核酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一多核苷酸被固定到所述固定载体。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述第一多核苷酸包括包含CRISPR/Cas9末端序列的3'部分以及包含单链引导RNA(sgRNA)的5'部分，所述单链引导RNA指导所述CRISPR/Cas9酶以非序列特异性方式结合所述靶核酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述sgRNA包含(GC)n或(AT)n，其中n为5-20。
8.根据权利要求7所述的方法，其中n为10。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述sgRNA为10至40个核苷酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述sgRNA为17或20个核苷酸。
11.根据权利要求4至10中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸被生物素酰化，并且所述固体载体包括一种或多种生物素结合蛋白。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物素结合蛋白包括亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、抗生物素抗体、生物素受体和/或生物素结合酶。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述生物素结合酶包括生物素酶或生物素羧化全酶合成酶。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，包括洗涤上面固定有所述双链核酸片段的所述固体载体，以除去任何未结合的核酸。
15.根据权利要求4至14中任一项所述的方法，包括扩增固定在所述固体表面上的所述双链核酸片段。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述扩增包括提供聚合酶和对应于所述第一多核苷酸的一部分的扩增引物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中将所述靶双链核酸施加到所述固体载体包括用降低所述CRISPR/Cas9酶的核酸结合特异性的一种或多种试剂处理所述CRISPR/Cas9酶。
18.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种试剂包括甜菜碱、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺和/或硫烷。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas9酶以至少103、104、105或106个酶/mm2的密度存在于所述固体载体上。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述固定文库中所述双链核酸片段的长度与所述固体载体上所述CRISPR/Cas9酶的密度成比例。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述固体载体包括微粒、图案化表面或孔。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述微粒是小珠。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，包括：(c)将嵌入染料施加到所述双链核酸片段的固定文库的至少一部分，以获得一组染色的固定片段；以及获得染色的固定片段的图像。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中施加靶双链核酸包括将生物样本添加到所述固体载体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物样本包括细胞裂解物。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物样本包括全细胞。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物样本选自由血液、血浆、血清、淋巴液、粘液、痰液、尿液、精液、脑脊液、支气管抽吸液、粪便和浸软组织组成的组。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，包括标记所述双链核酸片段。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述双链核酸片段用包含第一标签结构域的第一标签进行标记。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一标签结构域包含用于簇扩增的区域。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述第一标签结构域包含用于引发测序反应的区域。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，还包括从所述固体载体释放所述固定双链核酸片段。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述释放包括从所述固体载体裂解所述CRISPR/Cas9酶。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述释放包括进行聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)或其他扩增过程。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述PCR包括抑制PCR。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述释放包括施加光或热。
37.一种制备随机片段化双链核酸片段的固定文库的方法，包括：
(a)提供上面固定有CRISPR/Cas9复合物的固体载体，其中所述CRISPR/Cas9复合物包含与生物素酰化第一多核苷酸结合的CRISPR/Cas9酶，所述生物素酰化第一多核苷酸包括包含CRISPR/Cas9末端序列的3'部分以及包含单链引导RNA(sgRNA)的5'部分，所述单链引导RNA指导所述CRISPR/Cas9酶以非序列特异性方式结合所述靶核酸，并且其中所述生物素酰化第一多核苷酸与所述固体载体上的生物素结合蛋白结合；以及
(b)在靶双链核酸被所述CRISPR/Cas9复合物随机片段化并且所述CRISPR/Cas9复合物结合所述双链核酸片段的至少一条链的条件下，将所述靶双链核酸施加到所述固体载体；从而产生随机片...
【专利技术属性】
技术研发人员：尼尔·安东尼·戈麦利，
申请(专利权)人：ILLUMINA剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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