本发明专利技术提出了一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记及应用，属于基因工程技术领域，包括鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术利用已知位点的DNA序列信息设计出一对特异性的引物并改进一对特异性引物，用该引物扩增DNA片段，接着用限制性内切酶酶切PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段来鉴定不同的番茄材料；开发出dCAPS分子标记U11.5和改良的分子标记UG11.2，这两个分子标记可以用于苗期鉴定番茄果实是否携带绿色果肩这一特性。利用该标记方法不仅节约了田间育种成本，同时缩短了育种周期，加速了番茄育种进程。
【技术实现步骤摘要】
一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记及应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记及应用。
技术介绍
番茄(Solanumlycopersicum)又称西红柿，是茄科番茄属的一年或多年生的草本植物，是我国主栽蔬菜作物之一。番茄果实的均匀着色有利于番茄最适采收期的确定，同时能增加对消费者的吸引力。因此在长期以来的育种工作中，人们将番茄果实靠近果柄端不含绿果肩视为一个重要的育种目标，但是这一育种目标无意中导致了番茄果实中糖及风味物质含量的下降，降低了番茄成熟果实的品质。研究表明，未成熟的番茄果实也能够进行光合作用，并且能够贡献高达20％的果实光合产物，而果实的其余光合作用产物则从叶片部分转运而来。Powell研究发现U基因编码转录因子SLGLK2，在未成熟的番茄果实中纬向梯度表达来决定叶绿素的积累与分布，因此SLGLK2在果实的茎端有较高的表达从而使番茄形成绿果肩表型；Nadakuduti研究发现UG基因编码转录因子KNOX转录因子TKN4，TKN4通过调控SLGLK2的纬度梯度表达来调控叶绿素的纬度梯度分布。两者共同作用导致番茄未成熟果实的果肩呈现为深绿色，同时提高了果实的光合能力，提高淀粉含量，最终促进糖在成熟果实中的积累，因此番茄的绿色果肩表型通过影响果实的营养价值和口感直接影响番茄品质。番茄绿肩性状由U和UG两个基因控制，当基因U和UG同时存在时，番茄未成熟果实才呈现出绿色果肩性状。Powell研究发现基因u与U相比，仅仅是在SL2.40ch10:2292260-2292267之间有一个单碱基A的插入的区别。因为这个单碱基A的插入，导致在翻译过程中使得终止密码子提前到来。因此U基因编码一个具有310个氨基酸的蛋白质，而u基因只能编码一个被截断的80个氨基酸长度的蛋白质，导致无法行使原有正常的蛋白功能而无法形成绿色果肩；Nadakuduti研究发现突变体ug破坏了SLGLK2在未成熟果实中的梯度表达，使得绿色果肩消失。突变体ug第二外显子内发生了碱基T→A的替换，导致原本应该编码的苯丙氨酸被亮氨酸所取代，改变了蛋白原有的功能，破坏了番茄未成熟果实中叶绿素的梯度分布，因而不能形成绿色果肩。Nadakuduti针对UG基因开发出了相关的CAPS分子标记，但由于该分子标记在实际检测运用中易出现污染现象，影响检测结果的准确性，因此本专利对Nadakuduti开发出的分子进行了改进，但针对U基因并没有相关连锁的DNA分子标记报道。专利CN111996192A涉及植物基因编辑
，具体涉及一种通过基因编辑技术创制果实无绿色青肩番茄材料的方法及应用，包括创制果实无绿色青肩番茄材料的靶标位点、引物、表达载体及其应用。该专利技术针对SlGLK2基因进行进一步的研究，利用CRISPR/Cas9技术快速创制新材料、培育新品种，且可以分离筛选掉转基因载体，不涉及转基因争议，具有一定的商业价值，但是，该方法复杂，且无法只鉴别番茄是否有绿色果肩，而不影响番茄的遗传规律。选育绿色果肩番茄对提高番茄品质具有重要的意义。在番茄苗期，使用与番茄绿肩性状紧密连锁的分子标记能够高效和准确地鉴定番茄绿色果肩性状，并鉴定相关基因型，不受发育时期和环境条件的限制，从而加速番茄的育种进程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记及应用，根据已知序列的U基因，获得一个鉴定番茄绿色果肩性状的dCAPS分子标记，并且此标记利用琼脂糖凝胶电泳可以清晰的显示差异，便于应用于筛选果实带有绿色果肩的番茄品种。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。5’-TCTTTGAATGAGTTGATTATCTGTTGTAGCAGGTAATTTGTCTTATTTTCAACATTACAAAAATTTAAGAGTTTAAGGAGAGACTTATCTACACATTTAACTAATTTATAACAGATAATTTATCTTATTTTTAAAATTACGAATCTCATTTTACGAAAAGGCTTGCTTGTCTATATTCTTTGAATAATTGATTATCTGTTATATCGAGTAATTTAGGTTGATTCTCAATATTACAAATCTCACATTTTAAGATGCTGGCATTTGTGTGATTCTTATCTTTTAGTGACTTGTTATAGCATGTAATCTTATCTTACTTTTAATATTACTAATTAATCTTACATTTTTATTTTCTTGAAGGTTAATTATACTTATAGTATTTGAAATAATGCTTGCTCTATCTTCATCATTGAGCTACAAAAATGAAAGGGAAAATTATGATTTATTCCAAGATTTTTCCCATGGGAATTTAATCGACACCATCAATTTCGATGACTTTTTCGATGAAATCAACGGTGGAGATTTACTGCCAGATTTCGAAATTTTTTGTGAAGAACCTGCTATTCATGGAAATATGAAATCTAAGTCAAAAGAAGCTAAAAAA-/ATCATCTAGCAAAATCAAAAATCCTCAAGGAAAGAAAAAAGTAAAGGT-3’(参见SEQIDNO:1)，其中-为参考基因组对应碱基，A为突变碱基。本专利技术进一步保护一种如上述鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记的特异性引物对A，所述正向引物核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述反向引物核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。正向引物：5’-TCTTTGAATGAGTTGATTATCTGTT-3’(参见SEQIDNO:2)，反向引物：5’-ACCTTTACTTTTTTCTTTCCTTGAGGATTTTTGATTTTGCTAGATGCTTTTT-3’(参见SEQIDNO:3)。本专利技术一步保护一种如上述鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记的特异性引物对B，所述正向引物核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；所述反向引物核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。正向引物：5’-TCCAGCTCACGTCACAGTAGTG-3’(参见SEQIDNO:4)，反向引物：5’-AATTATCTTTGCATAGGGAACTGAG-3’(参见SEQIDNO:5)。本专利技术进一步保护一种如上述特异性引物对A的扩增序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。5’-TCTTTGAATGAGTTGATTATCTGTTGTAGCAGGTAATTTGTCTTATTTTCAACATTACAAAAATTTAAGAGTTTAAGGAGAGACTTATCTACACATTTAACTAATTTATAACAGATAATTTATCTTATTTTTAAAATTACGAATCTCATTTTACGAAAAGGCTTGCTTGTCTATATTCTTTGAATAATTGATTATCTGTTATATCGAGTAATTTAGGTTGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.如权利要求1所述鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记U11.5的特异性引物对A，其特征在于，所述正向引物核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述反向引物核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
3.如权利要求1所述鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记UG11.2的特异性引物对B，其特征在于，所述正向引物核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；所述反向引物核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。
4.一种如权利要求2所述特异性引物对A的扩增序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
5.一种如权利要求3所述特异性引物对B的扩增序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。
6.如权利要求1所述dCAPS分子标记在鉴定番茄绿色果肩基因型中的应用。
7.如权利要求2所述特异性引物对A在鉴定番茄绿色果肩基因型中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用所述特异性引物对A对待测番茄基因组DNA进行PCR扩增，所得到的PCR产物经过限制性内切酶HpyF10VI酶切，若获得的酶切产物是长度分别为599bp和49bp的两条片段，则待测番茄材料携带绿色果肩基因U且为纯合基因型UU；若获得的酶切产物是长度分别为649bp、599bp和49bp三条片段，则待测番茄材料携带绿色果肩基因U且为杂合基因型Uu；若所得到的PCR产物经过限制性内切...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘杨，张卓，陈火英，袁书昱，何甬丑琳，何永军，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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