一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种SARS‑CoV和COVID‑19病毒双重PCR检测方法，包括如下步骤：S1、准备病毒cDNA模板；S2、试剂耗材准备；S3、引物的设计；S4、病毒基因的合成；S5、单一PCR扩增；S6、双重PCR扩增及条件优化；S7、双重PCR的特异性检测；S8、双重PCR方法的灵敏度检测；本发明专利技术在病毒基因合成后通过对病毒进行单一PCR扩增和双重扩增，在扩增时需对病毒进行引物浓度条件和退火温度条件的双重优化，最后使用其他常见的呼吸系统疾病病毒进行PCR，确定建立双重PCR方法的特异性，结果显示，设计的引物只能特异性的检测到SARS‑CoV和COVID‑19两种病毒质粒模板，而对实验的其他病毒不能检测，一定程度上提高从诸多病毒中检测出SARS‑CoV和COVID‑19病毒的有效性。

【技术实现步骤摘要】
一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法
本专利技术属于实验室病菌检测
，具体涉及一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法。
技术介绍
新型冠状病毒肺炎COVID-19是由新型冠状病毒SARS-CoV感染所致的疾病，由于新型冠状病毒肺炎具有极强的传染性，为控制病毒的传播，需通过有效的方式检测出病毒，并根据检测的病毒进行有效的控制，但是，在实验室病毒检测时，因每种病毒基因团中含有不同的病毒，如含有SARS-CoV、COVID-19、MERS-CoV、甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒和腺病毒，检测时不能有效的从诸多病毒中检测出SARS-CoV和COVID-19病毒，且检测病毒的方法灵敏度低，因此，我们提出一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法，通过双重PCR扩增及条件优化，再进行双重PCR的特异性检测和PCR方法灵敏度检测以解决上述
技术介绍
中提出现有技术中不能有效的从诸多病毒中检测出SARS-CoV和COVID-19病毒，且检测病毒的方法灵敏度低的问题。为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法，包括如下步骤：S1、准备病毒cDNA模板，准备SARS-CoV、COVID-19、MERS-CoV、甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒和腺病毒的模板；<br>S2、试剂耗材准备，准备模板克隆试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂和PCR扩增试剂；S3、引物的设计，从GenBank获得SARS-CoV和COVID-19毒株的完整基因序列，并通过BioXM2.6软件对病毒基因序列的保守区域进行比对，使用PrimerPremier5软件设计每种病毒的特异性引物；S4、病毒基因的合成，将SARS-CoV、COVID-19、MERS-CoV和甲型流感病毒H1N1进行待测基因片段合成，然后克隆至pUC57载体，测序正确后提取质粒备用；S5、单一PCR扩增，每个反应系统的总体积为25μL，含有12.5μL2×MasterMix，上下游引物各1μL(10pmol/L)，合成的病毒质粒模板1μL，9.5μL的ddH2O，PCR反应条件为：94℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃、10min；最后12℃保存；通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并置于凝胶成像系统中观察扩增结果；S6、双重PCR扩增及条件优化，将两种病毒质粒等比例混合，按照S5反应条件和反应体系进行PCR扩增，扩增PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，并用凝胶成像系统进行观察，双重PCR扩展的条件优化包括引物浓度优化和退火温度优化，其中引物浓度优化是将SARS-CoV和COVID-19的上下游引物按照不同的浓度进行PCR，组合分别为：10pmol/L+10pmol/L、5pmol/L+5pmol/L、10pmol/L+5pmol/L、5pmol/L+10pmol/L、3pmol/L+3pmol/L，确定最优引物浓度；退火温度优化是设定不同PCR退火温度，即50℃、53℃、56℃、58℃和60℃，确定最优PCR反应退火温度；S7、双重PCR的特异性检测，使用其他常见的呼吸系统疾病病毒，即甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒、人类冠状病毒MERS-CoV、腺病毒的cDNA作为模板进行PCR，根据电泳结果观察引物特异性；S8、双重PCR方法的灵敏度检测，通过10倍梯度稀释将混合质粒从1×108拷贝/μL稀释至1×100拷贝/μL，用于检测双重方法的灵敏度。优选的，步骤2中所述模板克隆试剂包括pUC57载体、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉和Amp，所述琼脂糖凝胶电泳试剂包括琼脂糖、核酸染料Goldview、DNAMarker(DL2000)和TBE溶液，所述PCR扩增试剂包括引物、2×MasterMix和ddH2O。优选的，步骤4中所述SARS-CoV、COVID-19和MERS-CoV的扩增长度设置为3001-3348bp，所述甲型流感病毒H1N1的基因登录号为DJ399201.1。优选的，步骤5中所述单一PCR扩增和步骤6中所述双重PCR扩增是以人工合成的SARS-CoV和COVID-19ORF1ab片段作为模板，采用SARS-CoV和COVID-19设计合成的特异性引物进行单一PCR扩增和双重PCR扩增，扩增结果显示，单一PCR扩增或双重PCR扩增均能够扩增出特异性片段，而且大小与预期一致，经测序正确，说明合成基因片段正确，设计引物能够特异性的扩增出目的片段。优选的，步骤6中所述引物浓度优化是将SARS-CoV和COVID-19病毒的上下游引物按照不同的浓度进行PCR，经PCR扩增和电泳检测发现两种病毒检测上下游引物分别为5pmol/L+5pmol/L时最合适。优选的，步骤6中所述退火温度优化是按照最优PCR反应体系，在不同PCR退火温度下进行扩增，扩增结果为SARS-CoV和COVID-19这两种病毒检测最佳退火温度为58℃。优选的，步骤7中所述使用其他常见的呼吸系统疾病病毒进行PCR，确定建立双重PCR方法的特异性，结果显示，设计的引物只能特异性的检测到SARS-CoV和COVID-19两种病毒质粒模板，而对实验的其他病毒不能检测。优选的，步骤8中所述双重PCR方法的灵敏度检测通过10倍梯度稀释将混合两种病毒质粒从1×107拷贝/μL稀释至1×100拷贝/μL，进行PCR扩增，结果显示建立的PCR诊断方法能够检测到的最低病毒基因片段质粒浓度为1×102拷贝/μL。本专利技术提出的一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法，与现有技术相比，具有以下优点：1、本专利技术在病毒基因合成后通过对病毒进行单一PCR扩增和双重扩增，在扩增时需对病毒进行引物浓度条件和退火温度条件的双重优化，最后使用其他常见的呼吸系统疾病病毒进行PCR，确定建立双重PCR方法的特异性，结果显示，设计的引物只能特异性的检测到SARS-CoV和COVID-19两种病毒质粒模板，而对实验的其他病毒不能检测，一定程度上提高从诸多病毒中检测出SARS-CoV和COVID-19病毒的有效性；2、本专利技术通过10倍梯度稀释将混合质粒从1×108拷贝/μL稀释至1×100拷贝/μL检测双重方法的灵敏度，通过建立的PCR诊断方法能够检测到的最低病毒基因片段质粒浓度为1×102拷贝/μL，具有较好的灵敏度。附图说明图1为本专利技术的流程框图；图2为本专利技术的PCR扩增结果示意图；图3为本专利技术的过滤装置箱体剖面；图4为本专利技术的下水滤网的结构示意图；图5为特异性检测结果示意图；图6为PCR扩增结果示意图；图2中：A：A、单一PCR扩增；M、marker2000；1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：/nS1、准备病毒cDNA模板，准备SARS-CoV、COVID-19、MERS-CoV、甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒和腺病毒的模板；/nS2、试剂耗材准备，准备模板克隆试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂和PCR扩增试剂；/nS3、引物的设计，从GenBank获得SARS-CoV和COVID-19毒株的完整基因序列，并通过BioXM 2.6软件对病毒基因序列的保守区域进行比对，使用Primer Premier 5软件设计每种病毒的特异性引物；/nS4、病毒基因的合成，将SARS-CoV、COVID-19、MERS-CoV和甲型流感病毒H1N1进行待测基因片段合成，然后克隆至pUC57载体，测序正确后提取质粒备用；/nS5、单一PCR扩增，每个反应系统的总体积为25μL，含有12.5μL 2×Master Mix，上下游引物各1μL(10pmol/L)，合成的病毒质粒模板1μL，9.5μL的ddH2O，PCR反应条件为：94℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃、10min；最后12℃保存；通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并置于凝胶成像系统中观察扩增结果；/nS6、双重PCR扩增及条件优化，将两种病毒质粒等比例混合，按照S5反应条件和反应体系进行PCR扩增，扩增PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，并用凝胶成像系统进行观察，双重PCR扩展的条件优化包括引物浓度优化和退火温度优化，其中引物浓度优化是将SARS-CoV和COVID-19的上下游引物按照不同的浓度进行PCR，组合分别为：10pmol/L+10pmol/L、5pmol/L+5pmol/L、10pmol/L+5pmol/L、5pmol/L+10pmol/L、3pmol/L+3pmol/L，确定最优引物浓度；退火温度优化是设定不同PCR退火温度，即50℃、53℃、56℃、58℃和60℃，确定最优PCR反应退火温度；/nS7、双重PCR的特异性检测，使用其他常见的呼吸系统疾病病毒，即甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒、人类冠状病毒MERS-CoV、腺病毒的cDNA作为模板进行PCR，根据电泳结果观察引物特异性；/nS8、双重PCR方法的灵敏度检测，通过10倍梯度稀释将混合质粒从1×10...

【技术特征摘要】
1.一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、准备病毒cDNA模板，准备SARS-CoV、COVID-19、MERS-CoV、甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒和腺病毒的模板；
S2、试剂耗材准备，准备模板克隆试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂和PCR扩增试剂；
S3、引物的设计，从GenBank获得SARS-CoV和COVID-19毒株的完整基因序列，并通过BioXM2.6软件对病毒基因序列的保守区域进行比对，使用PrimerPremier5软件设计每种病毒的特异性引物；
S4、病毒基因的合成，将SARS-CoV、COVID-19、MERS-CoV和甲型流感病毒H1N1进行待测基因片段合成，然后克隆至pUC57载体，测序正确后提取质粒备用；
S5、单一PCR扩增，每个反应系统的总体积为25μL，含有12.5μL2×MasterMix，上下游引物各1μL(10pmol/L)，合成的病毒质粒模板1μL，9.5μL的ddH2O，PCR反应条件为：94℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃、10min；最后12℃保存；通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并置于凝胶成像系统中观察扩增结果；
S6、双重PCR扩增及条件优化，将两种病毒质粒等比例混合，按照S5反应条件和反应体系进行PCR扩增，扩增PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，并用凝胶成像系统进行观察，双重PCR扩展的条件优化包括引物浓度优化和退火温度优化，其中引物浓度优化是将SARS-CoV和COVID-19的上下游引物按照不同的浓度进行PCR，组合分别为：10pmol/L+10pmol/L、5pmol/L+5pmol/L、10pmol/L+5pmol/L、5pmol/L+10pmol/L、3pmol/L+3pmol/L，确定最优引物浓度；退火温度优化是设定不同PCR退火温度，即50℃、53℃、56℃、58℃和60℃，确定最优PCR反应退火温度；
S7、双重PCR的特异性检测，使用其他常见的呼吸系统疾病病毒，即甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒、人类冠状病毒MERS-CoV、腺病毒的cDNA作为模板进行PCR，根据电泳结果观察引物特异性；
S8、双重PCR方法的灵敏度检测，通过10倍梯度稀释将混合质粒从1×108拷贝/μL稀释至1×100拷贝/μL，用于检测双重方法的灵敏度。


2.根据权利要求1所述的一种SARS-CoV和COVID-19病毒双重PCR检测方法，其特征在于：步骤2中所述模板克隆试剂包括pUC57载体、胰蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟振东，鄢林霞，罗丹，阳丹丹，俞雨阳，
申请(专利权)人：成都里来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51