一种植物来源启动子、表达载体及应用制造技术

本发明专利技术公开一种植物来源启动子、表达载体及应用，涉及基因工程技术领域；本发明专利技术公开的植物来源的高表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；其是对拟南芥原启动子的碱基进行了更改，在保持原启动子功能的基础上，又能够避免被限制性内切酶切开的问题；本发明专利技术创建的表达载体适用于单子叶和双子叶植物，解决了现有载体所采用的Ubiqutin启动子序列太长、不易转化及双子叶植物表达丰度低的问题，也解决了CaMV35S启动子单子叶植物表达丰度偏低以及潜在的安全性问题；本发明专利技术创造性的在ccdB毒性蛋白的两端，分别加入多克隆位点，既能够满足限制性内切酶的需要，也能有效的抑制载体的假阳性。

【技术实现步骤摘要】
一种植物来源启动子、表达载体及应用
本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种植物来源启动子、表达载体及应用。
技术介绍
近年来，随着经济社会的发展和人民生活水平的提高，大众对粮食产量和品质的需求越来越高。但我国耕地面积有限，通过扩大种植面积提高产量的方法愈发困难。选育新的品种、提高单位面积产量是解决粮食供需矛盾最有效的方式。然而，采用传统方法进行品种选育耗时长、盲目性高、效率低，远不能满足当前农业的需求。生物技术的快速发展为加快育种速度提供了新的选择，如基因编辑、转基因等。然而，生物技术在品种选育中的推广和应用，亟需解决的关键问题是作物重要农艺性状功能基因的解析。基因功能研究是加快育种效率的前提条件，构建含有目的基因的表达载体是研究基因功能的有效手段。当前基因功能研究中用到的表达载体的启动子几乎都是病毒来源的CaMV35S，极少数为植物来源的Ubiqutin。病毒来源的CaMV35S启动子可能具有潜在的安全隐患，而植物来源的Ubiqutin启动子则由于其碱基序列太多，限制了转基因的应用。目前常用的载体构建方法有Gateway载体的同源重组法和pCambia载体的酶切连接方法。Gateway系列载体利用载体上面的attR和attL序列，通过同源重组酶，将片段插入到载体中，采用毒性蛋白ccdB和相应的抗生素进行筛选；pCambia系列载体一般是采用限制性内切酶酶切，将载体片段化，然后采用T4连接酶等将基因片段连接到载体中。上述两种载体系统中的过表达载体，所采用的启动子全为烟草花叶病毒来源的CaMV35S，存在一定的生物安全风险；即使是植物来源的启动子，其碱基序列长度太长，且表达丰度不够高，影响基因功能的研究。目前，尚无植物来源且高水平表达的启动子驱动的过表达载体的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型植物来源启动子、表达载体及应用，以解决上述现有技术存在的问题。为实现上述目的，本专利技术提供一种植物来源启动子，所述新型植物来源启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示。进一步的，所述植物来源启动子为与SEQIDNo：7所示的核苷酸序列具有80％或80％以上同源性的核苷酸序列，且具有启动子的功能。本专利技术还提供一种所述的植物来源启动子在制备重组表达载体中的应用。进一步的，所述重组表达载体中含有ccdB毒性蛋白。进一步的，所述重组表达载体中含有驱动除草剂基因的启动子。本专利技术还提供一种包含所述的植物来源启动子的重组表达载体。进一步的，所述重组表达载体中含有ccdB毒性蛋白。进一步的，所述重组表达载体中含有驱动除草剂基因的启动子。本专利技术还提供一种所述的重组表达载体在植物中启动目的基因表达的应用。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术公开的植物来源的、高表达的启动子是对拟南芥原启动子的碱基进行了更改，在保持原启动子功能的基础上，又能够避免被限制性内切酶切开的问题。本专利技术中创建的载体适用于单子叶植物和双子叶植物，解决了现有载体所采用的Ubiqutin启动子序列太长、不易转化以及双子叶植物表达丰度低的问题，也解决了CaMV35S启动子单子叶植物表达丰度偏低以及潜在安全性问题；同时，由于载体中含有ccdB毒性蛋白，能够有效地抑制假阳性。本专利技术创造性的构建了双多克隆位点，即在ccdB毒性蛋白的两端，分别加入多克隆位点，既能够满足限制性内切酶的需要，也能有效的抑制载体的假阳性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为新的人工改造植物来源的启动子电泳；其中，泳道1为DL2000marker；泳道2和3分别为启动子的两个片段；泳道4为所述新的人工改造植物来源的启动子；图2为合成的含有双多克隆位点ccdB基因片段的电泳结果，其中，泳道1是DL2000marker，泳道2和3是含有双多克隆位点ccdB基因的片段；图3为植物来源启动子驱动除草剂基因basta及目的基因片段的PCR结果；其中，泳道1为DL2000marker，泳道2为克隆得到的含有同源重组片段的basta基因，泳道3为驱动basta基因的植物来源启动子，泳道4为启动子连接片段，泳道5为用于驱动目的基因的启动子片段，泳道6为pCambia3301H经XhoI+HindIII双酶切后的大片段，泳道7为片段3的环形质粒；图4为植物来源启动子过表达载体的示意图；图5为所述植物来源启动子过表达载体通过转基因整合到植物基因组的示意图；图6为GRMZM2G125777基因的克隆及载体酶切电泳图；其中，泳道1为GRMZM2G125777CDS区PCR结果，泳道2为本专利技术专利创建的过表达载体采用EcoRI酶切电泳图；图7为基因转化拟南芥，对T0代种子幼苗进行除草剂报告基因筛选结果；图8为应用例1创建的转基因材料中GRMZM2G125777的表达水平与CaMV35S驱动的GRMZM2G125777转基因材料的表达水平；图9为野生型拟南芥与转基因拟南芥的生长状况。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。实施例1新型植物来源启动子片段(片段0)的创建(1)采用2×CTAB方法，提取温室种植5周龄拟南芥叶片。经微量紫外分光光度计测定，其DNA浓度为1024ng/μL。(2)以野生型拟南芥DNA为模板，通过PCR分别克隆启动子的两个片段。片段0的第一部分(大小为154bp，不含adapter)所采用的引物：SAAS0302F：ATAGGCAACCGTGGACTTCTTC(SEQIDNO：1)；SAAS0305R：TTACAGGGATAAATTCGAATCAATTCGTATATTGACTAGT(SEQIDNO：2)。扩增序列为如下：ATAGGCAACCGTGGACTTCTTCACTAGCTCATCGAGATAGCAATGCCACTAGCTAATTTCTTACGTTGTATCTTATTTGTTTTACTTTGGGGCATGACATGGTTAAACCCCATCAAAGAGAAAGTGTTTCATCCACTAGTCAATATACGAATTGATTCGAATTTATCCCTGTAA(SEQIDNO：3)。片段0的第二部分(大小为302bp)所采用的引物，其中引入一个错配碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物来源启动子，其特征在于，所述植物来源启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种植物来源启动子，其特征在于，所述植物来源启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示。


2.根据权利要求1所述的植物来源启动子，其特征在于，所述植物来源启动子为与SEQIDNo：7所示的核苷酸序列具有80％或80％以上同源性的核苷酸序列，且具有启动子的功能。


3.一种如权利要求1或2所述的植物来源启动子在制备重组表达载体中的应用。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体中含有ccdB毒性蛋白。

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【专利技术属性】
技术研发人员：程文，丁照华，唐媛，赵苏娴，王志武，卢增斌，尹昌果，
申请(专利权)人：山东省农业科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37