特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用，属于生物医药领域。本发明专利技术还公开了一种基于CRISPR系统构建人AXL基因敲除细胞的方法。本发明专利技术所述的sgRNA可以介导Cas9蛋白高效地切割靶点DNA，进而用于编辑人AXL基因。本发明专利技术的sgRNA可以通过CRIPSR/Cas9系统实现高效打靶。

【技术实现步骤摘要】
特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用。
技术介绍
AXL一词源于希腊语“Anexelekto”，意为不受控制的，AXL与TYRO3、MER共同组成受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase，RTK)中的TAM家族。AXL基因位于染色体19q13.2，共有20个外显子，编码一个含有894个氨基酸的蛋白分子。在结构上，AXL包含3个结构域：胞外结构域、跨膜域和胞内域。AXL的配体为生长停滞特异性蛋白6(growtharrestspecificprotein6，Gas6)。AXL的激活方式包括：配体依赖的激活和配体非依赖的激活。1988年，研究者在慢性髓性白血病患者向急性期转化的相关基因筛选中发现了AXL[1]。1991年，两个课题组报道了AXL是一种具有转化潜力的受体酪氨酸酶，但它在细胞内的作用不清楚，其中一个研究组将其命名为UFO，意为未知功能的[2,3]。1996年，AXL被证明能够影响成纤维细胞的有丝分裂和生存[4]。近年来的研究发现AXL激活后能够活化下游多个信号通路，包括激活肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶C(PKC)等。AXL在肺腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等多种肿瘤组织中过表达，并参与调控肿瘤侵袭、转移和耐药等过程[5,6]。以AXL为靶点开发小分子抑制剂和抗体是肿瘤治疗领域的热点之一。Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)被称为第三代人工核酸内切酶，可用于各种复杂基因组的编辑。由于其突变效率高、靶向精准、操作简单、周期短及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA--crRNA(CRISPRRNA)、tracrRNA(trans-activatingcrRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(singleguideRNA)。因此，sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性敲除目标基因的先决条件。能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术。利用CRISPR系统进行针对AXL的基因编辑可以为肿瘤免疫治疗提供一种快速、简便、高效的策略。[1]LIUE,HJELLEB,BISHOPJM.Transforminggenesinchronicmyelogenousleukemia[J].ProcNatlAcadSciUSA,1988,85(6):1952-1956.[2]O'BRYANJP,FRYERA,COGSWELLPC,etal.axl,atransforminggeneisolatedfromprimaryhumanmyeloidleukemiacells,encodesanovelreceptortyrosinekinase[J].MolCellBiol,1991,11(10):5016-5031.[3]JANSSENJ,SCHULZA,STEENVOORDENA,etal.Anovelputativetyrosinekinasereceptorwithoncogenicpotential[J].Oncogene,1991,6(11):2113-2120.[4]GORUPPIS,RUAROE,SCHNEIDERCJO.Gas6,theligandofAxltyrosinekinasereceptor,hasmitogenicandsurvivalactivitiesforserumstarvedNIH3T3fibroblasts[J].Oncogene,1996,12(3):471-480.[5]TSUKITAY,FUJINON,MIYAUCHIE,etal.Axlkinasedrivesimmunecheckpointandchemokinesignallingpathwaysinlungadenocarcinomas[J/OL].MolCancer,2019,18(1):24.[20-11-20].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6369543/.[6]ZHUCJ,WEIYQ,WEIXW.AXLreceptortyrosinekinaseasapromisinganti-cancerapproach:functions,molecularmechanismsandclinicalapplications[J/OL].MolCancer,2019,18(1):153[20-11-20].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6827209/.
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供特异性靶向人AXL基因的sgRNA。本专利技术的第二目的在于提供一种可用于人AXL基因编辑的载体。本专利技术的第三目的在于提供一种基于CRISPR系统构建人AXL基因敲除细胞的方法。为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术第一方面提供了特异性靶向人AXL基因的sgRNA，所述的sgRNA序列包括sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5、sgRNA6、sgRNA8中任意一种或多种，所述sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA位于人AXL基因剪切变体201和202共同第一外显子区，所述sgRNA5、sgRNA6、sgRNA8位于人AXL基因剪切变体203第一外显子区。进一步，所述的sgRNA1序列如SEQIDNO.1所示，所述的sgRNA2序列如SEQIDNO.2所示，所述的sgRNA3序列如SEQIDNO.3所示，所述的sgRNA4序列如SEQIDNO.4所示，所述的sgRNA5序列如SEQIDNO.5所示，所述的sgRNA6序列如SEQIDNO.6所示，所述的sgRNA8序列如SEQIDNO.8所示。进一步，所述的sgRNA序列包括sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5和sgRNA8的组合。本专利技术第二方面提供了一种基因编辑载体，所述的载体包含本专利技术第一方面所述的sgRNA。本专利技术第三方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括本专利技术第一方面所述的sgRNA或本专利技术第二方面所述的载体。本专利技术第四方面提供了一种基于CRISPR系统构建人AXL基因敲除细胞的方法，所述的方法向细胞中递送本专利技术第一方面所述的sgRNA或本专利技术第二方面所述的载体，得到人AXL基因敲除的细胞。进一步，所述的细胞包括PANC-1细胞。进一步，所述的方法包括如下步骤：(1)构建携带本专利技术第一方面所述sgRNA的重组质粒；(2)将步骤(1)中的重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异性靶向人AXL基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA序列包括sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5、sgRNA6、sgRNA8中任意一种或多种，所述sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA位于人AXL基因剪切变体201和202共同第一外显子区，所述sgRNA5、sgRNA6、sgRNA8位于人AXL基因剪切变体203第一外显子区，优选的，所述的sgRNA1序列如SEQ ID NO.1所示，所述的sgRNA2序列如SEQ ID NO.2所示，所述的sgRNA3序列如SEQ ID NO.3所示，所述的sgRNA4序列如SEQ ID NO.4所示，所述的sgRNA5序列如SEQ ID NO.5所示，所述的sgRNA6序列如SEQ ID NO.6所示，所述的sgRNA8序列如SEQ ID NO.8所示，优选的，所述的sgRNA序列包括sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5和sgRNA8的组合。/n

【技术特征摘要】
1.特异性靶向人AXL基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA序列包括sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5、sgRNA6、sgRNA8中任意一种或多种，所述sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA位于人AXL基因剪切变体201和202共同第一外显子区，所述sgRNA5、sgRNA6、sgRNA8位于人AXL基因剪切变体203第一外显子区，优选的，所述的sgRNA1序列如SEQIDNO.1所示，所述的sgRNA2序列如SEQIDNO.2所示，所述的sgRNA3序列如SEQIDNO.3所示，所述的sgRNA4序列如SEQIDNO.4所示，所述的sgRNA5序列如SEQIDNO.5所示，所述的sgRNA6序列如SEQIDNO.6所示，所述的sgRNA8序列如SEQIDNO.8所示，优选的，所述的sgRNA序列包括sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5和sgRNA8的组合。


2.一种基因编辑载体，其特征在于，所述的载体包含权利要求1所述的sgRNA。


3.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的载体。


4.一种基于CRISPR系统构建人AXL基因敲除细胞的方法，其特征在于，所述的方法向细胞中递送权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的载体，得到人AXL基因敲除的细胞。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的细胞包括PANC-1细胞。


6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)构建携带权利要求1所述sgRNA的重组质粒；
(2)将步骤(1)中的重组质粒与Cas...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丹，刘禹辰，郑骏年，查俐，施明，赵璇，李思瑾，马文，
申请(专利权)人：徐州医科大学，南京国际医院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32