本发明专利技术提供了对映‑贝壳杉烷二萜weisiensin B和leukamenin E在制备治疗表皮细胞角蛋白K14相关皮肤疾患药物中的用途，weisiensin B和leukamenin E可浓度‑时间依赖性地抑制人永生化表皮细胞Hacat中的角蛋白K14二硫键的形成，从而抑制Hacat细胞角蛋白K14纤维的组装，且weisiensin B具有靶向结合角蛋白K14的特性；二者对Hacat细胞角蛋白K14二硫键的破坏作用直接抑制细胞铺展导致细胞生长的抑制效应，可用于由表皮细胞角蛋白K14异常表达导致的相关皮肤疾患的病理机制研究，对于治疗角蛋白K14相关皮肤疾患的药物研发具有非常重要的价值。
【技术实现步骤摘要】
对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及对映-贝壳杉烷二萜weisiensinB和leukameninE在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，特别涉及对映-贝壳杉烷二萜weisiensinB和leukameninE在制备治疗角蛋白K14相关皮肤疾患药物中的应用。
技术介绍
角蛋白是一类由角蛋白基因编码的聚合多肽组成的蛋白质，其不仅对上皮细胞和组织的完整性具有重要的机械稳定作用，还参与组织细胞分化和发育，细胞内信号转导，细胞凋亡以及伤口愈合，并具有防御保护等监管职能。目前，已有至少8种不同的皮肤疾患被证实与角蛋白的高表达相关。角蛋白K14是一种分子量为53KD的蛋白，其功能异常会导致皮肤疾患，现已明确，K14高表达将导致银屑病、扁平苔藓、尖锐湿疣等（ChineseJournalOfMedicinalGuide,2010Volume12No.8）疾患。角蛋白纤维(Keratinintermediatefilaments)是上皮细胞中主要的中间纤维类型，共有54个保守的功能基因编码不同的角蛋白。包括28种I型角蛋白和26种II型角蛋白。在人类物种中，除角蛋白18(Keratin18，K18)外，所有的I型角蛋白由17号染色体编码，而所有的II型角蛋白，包括编码K18的基因，都出现在12号染色体的长臂上。在正常上皮细胞中，角蛋白纤维提供了关键的结构和机械支持，以保护上皮细胞和组织免受机械和非机械应力损伤。这种结构和机械支持作用的异常会导致细胞组织脆性，并导致许多角质细胞相关疾病。目前为止，对于中间纤维有缺陷导致的皮肤疾患还没有有效的治疗药物。对映-贝壳杉烷(ent-Kaurane)二萜是一类具有多种生物活性的天然产物，对该化合物的研究多集中在抗菌、抗炎、抗肿瘤等方面，尚无治疗皮肤疾患方面的报道。
技术实现思路
基于以上所述，本专利技术的目的是提供对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，所述对映-贝壳杉烷二萜化合物是指weisiensinB和leukameninE。进一步地，通过MTT法、台盼蓝排染法以及AO/EB双染色法检测发现，weisiensinB和leukameninE可浓度-时间依赖性地抑制人永生化表皮细胞Hacat的增殖。进一步地，利用免疫荧光技术和蛋白质免疫印迹技术发现，weisiensinB和leukameninE可显著减少或抑制已铺展Hacat细胞内角蛋白K14纤维的组装并增加纤维可溶性，即weisiensinB和leukameninE通过抑制角蛋白K14纤维组装抑制表皮细胞的增殖及铺展。进一步地，利用间接免疫荧光技术对角蛋白K14和K14的二硫键进行共定位以及蛋白质免疫印记技术检测K14的含量变化发现，weisiensinB和leukameninE可抑制已铺展细胞内角蛋白K14纤维二硫键的形成从而抑制角蛋白K14纤维组装，即weisiensinB和leukameninE通过抑制角蛋白K14纤维组装过程中二硫键的形成而抑制Hacat细胞的增殖及铺展。进一步地，通过合成生物素标记的weisiensinB探针分子以及亲和柱层析法分离提纯与weisiensinB作用的蛋白并进行检测发现，weisiensinB与角蛋白K14具有直接靶向作用。更进一步地，所述皮肤疾患包括但不限于银屑病、扁平苔藓、尖锐湿疣。识别生物活性分子的细胞靶点是药物开发中的一个重大挑战和关键所在。蛋白质为细胞生命活动功能的执行者，研究生物活性分子与靶蛋白的相互作用极其重要。本专利技术提供了对映-贝壳杉烷二萜weisiensinB和leukameninE在制备治疗表皮细胞角蛋白K14相关皮肤疾患药物中的用途，weisiensinB和leukameninE可浓度-时间依赖性地抑制人永生化表皮细胞Hacat中的角蛋白K14二硫键的形成，从而抑制Hacat细胞角蛋白K14纤维的组装，且weisiensinB具有靶向结合角蛋白K14的特性；二者对Hacat细胞角蛋白K14二硫键的破坏作用直接抑制细胞铺展导致细胞生长的抑制效应，可用于由表皮细胞角蛋白K14异常表达导致的相关皮肤疾患的病理机制研究，对于治疗角蛋白K14相关皮肤疾患的药物研发具有非常重要的价值。附图说明图1是实施例1中weisiensinB或leukameninE抑制Hacat细胞增殖的结果；图2、3是实施例2中weisiensinB与leukameninE抑制Hacat细胞内角蛋白纤维组装的结果；图4、5、6、7、8是实施例2中weisiensinB与leukameninE抑制Hacat细胞铺展以及各个时间段铺展中Hacat细胞内角蛋白纤维组装的结果；图9是实施例3中BPW探针分子的合成路线；图10是实施例3中weisiensinB与BPW活性的检测的比较分析结果；图11是实施例3中BPW分别处理已铺展和铺展中Hacat细胞4h、6h、8h、10h、12h后的细胞总蛋白的链霉亲和素-辣根过氧化物酶印迹显影以及K14单抗印迹显影；图12是实施例3中利用BPW-亲和柱钓取目标蛋白并分别以链霉亲和素-辣根过氧化物酶和K14单抗进行印迹显影的结果；图13、14是实施例4中weisiensinB抑制已铺展和铺展中Hacat细胞内K14的二硫键形成的结果；图15是实施例4中weisiensinB和leukameninE抑制已铺展Hacat细胞内K14多聚物形成的结果。具体实施方式下面将通过实施例及附图的形式对本专利技术的上述内容进行详细的阐述，但本专利技术的保护范围并不仅限于以下实施例。实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。对映-贝壳杉烷二萜化合物weisiensinB和leukameninE单体是由本实验室分别从甘肃产维西香茶菜和产毛叶香茶菜的干茎叶中采用常规方法提取分离得到。本实验所用化合物weisiensinB和leukameninE均以DMSO为溶剂，配制成10mM母液储存液于4℃冰箱保存。实施例1：weisiensinB和leukameninE可浓度依赖性地抑制Hacat细胞增殖1.1)MTT法检测细胞增殖率取对数生长期的Hacat细胞，浓度为10×104个/mL接种于96孔板(100μL/孔)，每组设3个平行。在培养箱中预培养24h后，加入含不同浓度weisiensinB和leukameninE的培养基，继续培养24h后，每孔加入20μL的MTT(5mg/mL)，孵育4h后弃去培养基，加入150μL的DMSO，震荡10min，490nm处测量OD值，并做出各药物浓度下的柱状图。1.2)实验结果MTT检测发现(如图1)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，其特征在于，所述对映-贝壳杉烷二萜化合物为weisiensin B 和leukamenin E。/n
【技术特征摘要】
1.对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，其特征在于，所述对映-贝壳杉烷二萜化合物为weisiensinB和leukameninE。
2.如权利要求1所述的对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，其特征在于，所述weisiensinB和leukameninE可以抑制表皮细胞的增殖。
3.如权利要求2所述的对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，其特征在于，所述weisiensinB和leukameninE通过抑制角蛋白K14纤维组装抑制表皮细胞的增殖。
【专利技术属性】
技术研发人员：丁兰，杨彩妹，许欣欣，刘国安，
申请(专利权)人：西北师范大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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