【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产3-岩藻糖基乳糖和转化乳糖的α-1,3-岩藻糖基转移酶
本专利技术涉及生产3-岩藻糖基乳糖(3-FL)的方法以及新鉴定的岩藻糖基转移酶，更具体地新鉴定的乳糖结合α-1,3-岩藻糖基转移酶多肽，以及它们的应用。此外，本专利技术提供了使用新鉴定的乳糖结合α-1,3-岩藻糖基转移酶生产3-岩藻糖基乳糖(3-FL)的方法。技术背景现在已经有80多种属于人乳寡糖(HMO)家族的化合物得到结构表征。这些HMO代表一类作为益生元起作用的复杂寡糖。此外，HMO与上皮表位的结构同源性说明了针对对细菌病原体的保护作用。在婴儿胃肠道内，HMO选择性地滋养选定细菌菌株的生长，并因此，在母乳喂养的婴儿中引发独特肠道微生物群的发展。这些人乳寡糖中的一些需要存在特定的岩藻糖基化的结构，这些结构很可能表现出特定的生物活性。生产这些岩藻糖基化的寡糖需要岩藻糖基转移酶的作用。这些岩藻糖基转移酶属于糖基转移酶家族，广泛表达于脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌、酵母和细菌中。它们催化岩藻糖残基从供体(通常是鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-岩藻糖))转移至受...
【技术保护点】
1.一种生产α-1,3-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法包括以下步骤：/na)提供具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性和具有使用乳糖作为受体底物的能力的多肽，其中所述多肽包含：/ni)编码保守的GDP-岩藻糖结合结构域[Y/W/L/H/F/M]X[T/S/C][E/Q/D/A][K/R](SEQID NO 33)的氨基酸序列；/nii)编码保守的[K/D][L/K/M]XXX[F/Y]结构域(SEQ ID NO 34)的氨基酸序列，和/niii)其中如果ii)的结构域等于DM[A/S]VSF(SEQ ID NO 36)，则另外地在N-末端区域存在保守的基序[N/H]XDPAXLD...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181218 EP 18213728.11.一种生产α-1,3-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性和具有使用乳糖作为受体底物的能力的多肽，其中所述多肽包含：
i)编码保守的GDP-岩藻糖结合结构域[Y/W/L/H/F/M]X[T/S/C][E/Q/D/A][K/R](SEQIDNO33)的氨基酸序列；
ii)编码保守的[K/D][L/K/M]XXX[F/Y]结构域(SEQIDNO34)的氨基酸序列，和
iii)其中如果ii)的结构域等于DM[A/S]VSF(SEQIDNO36)，则另外地在N-末端区域存在保守的基序[N/H]XDPAXLD(SEQIDNO35)；
其中X可以是任何不同的氨基酸；和
其中所述多肽的C-末端具有从GDP-岩藻糖结合结构域的第一个氨基酸开始的小于或等于100个氨基酸；
b)在其中所述多肽催化岩藻糖残基从供体底物转移至受体底物的条件下，使步骤a)的具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性的所述多肽与包含GDP-岩藻糖作为供体底物和乳糖作为受体底物的混合物接触，
从而产生α-1,3-岩藻糖基乳糖，
c)任选地分离所述α-1,3-岩藻糖基乳糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽在无细胞系统中提供。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽由包含编码所述多肽的多核苷酸的细胞产生。
4.根据权利要求1或3中任一项所述的方法，其中所述GDP-岩藻糖和/或乳糖由产生所述GDP-岩藻糖和/或乳糖的细胞提供。
5.根据权利要求1、3或4中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供经基因修饰以产生α-1,3-岩藻糖基乳糖的细胞，所述细胞包含至少一种编码用于α-1,3-岩藻糖基乳糖合成的酶的核酸序列，
所述细胞包含具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性和具有使用乳糖作为受体底物的能力的所述多肽的表达，
ii)在允许产生α-1,3-岩藻糖基乳糖的条件下在培养基中培养细胞，
iii)优选地从培养中分离α-1,3-岩藻糖基乳糖。
6.根据权利要求3所述的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供表达具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性和具有使用乳糖作为受体底物的能力的所述多肽的宿主细胞；
b)在允许产生α-1,3-岩藻糖基乳糖并允许表达具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性的所述多肽的合适的营养条件下使所述宿主细胞生长；
c)在步骤b)的同时或之后提供供体底物GDP-岩藻糖和受体底物乳糖，以便α-1,3-岩藻糖基转移酶多肽催化岩藻糖残基从GDP-岩藻糖向乳糖的转移，从而产生α-1,3-岩藻糖基乳糖；
d)任选地从宿主细胞或其生长的培养基中分离所述α-1,3-岩藻糖基乳糖。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中宿主细胞经转化或转染以表达具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性和具有使用乳糖作为受体底物的能力的外源多肽。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其特征在于通过在宿主细胞中同时表达的酶或通过宿主细胞的代谢来提供GDP-岩藻糖和/或乳糖。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其进一步包括α-1,3-岩藻糖基乳糖的纯化。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽选自由以下项目组成的组：
i)所附序列表中SEQIDNO6、2、4、8、10、12、14、16、20、22、28、30或32的任何一个；
ii)与SEQIDNO2、20或22的全长氨基酸序列具有87％或更高序列同一性的氨基酸序列；
iii)与SEQIDNO6、8、10、12、14、16、28、30或32的任何一个的全长氨基酸序列具有80％或更高序列同一性的氨基酸序列；
iv)SEQIDNO2、20或22所示的氨基酸序列的片段，其中所述片段包含其至少45个连续氨基酸；
v)SEQIDNO6、8、10、12、14、16、28、30或32的任何一个所示的氨基酸序列的片段，其中所述片段包含其至少10个连续氨基酸并具有乳糖结合α-1,3-岩藻糖基转移酶活性；
任选地，所述多肽通过N-末端和/或C-末端氨基酸延伸片段进一步修饰。
11.根据前述权利要求中任一项所述的生产3-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法进一步包括以下步骤中的至少一个：
i)向培养基中添加乳糖进料，所述乳糖进料每初始反应器体积包含至少50克、更优选地至少75克、更优选地至少100克、更优选地至少120克、更优选地至少150克乳糖，优选地以连续方式添加，并且优选地使得培养基的最终体积是添加所述乳糖进料之前的培养基体积的不大于3倍，优选地不大于2倍，更优选地小于2倍；
ii)在1天、2天、3天、4天、5天的过程中，通过进料溶液以连续方式向培养基中添加乳糖进料；
iii)在1天、2天、3天、4天、5天的过程中，通过进料溶液以连续方式向培养基中添加乳糖进料，并且其中所述乳糖进料溶液的浓度是50g/L，优选地75g/L，更优选地100g/L，更优选地125g/L，更优选地150g/L，更优选地175g/L，更优选地200g/L，更优选地225g/L，更优选地250g/L，更优选地275g/L，更优选地300g/L，更优选地325g/L，更优选地350g/L，更优选地375g/L，更优选地400g/L，更优选地为450g/L，更优选地500g/L，甚至更优选地550g/L，最优选地600g/L；并且其中优选地将所述溶液的pH设置在3至7并且其中优选地将所述进料溶液的温度保持在20℃至80℃；
iv)所述方法导致在所述培养基的最终体积中3-岩藻糖基乳糖浓度为至少50g/L，优选地至少75g/L，更优选地至少90g/L，更优选地至少100g/L，更优选地至少125g/L，更优选地至少150g/L，更优选地至少150g/L，更优选地至少175g/L，更优选地至少200g/L。
12.经基因修饰以产生α-1,3-岩藻糖基乳糖的宿主细胞，其中宿主细胞包含至少一种编码参与α-1,3-岩藻糖基糖合成的酶的核酸序列；所述细胞包含表达具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性和具有使用乳糖作为受体底物的能力的多肽，其中所述多肽包含：
i)编码保守的GDP-岩藻糖结合结构域[Y/W/L/H/F/M]X[T/S/C][E/Q/D/A][K/R](SEQIDNO33)的氨基酸序列；
ii)编码保守的[K/D][L/K/M]XXX[F/Y]结构域(SEQIDNO34)的氨基酸序列，和
iii)其中如果ii)的结构域等于DM[A/S]VSF(SEQIDNO36)，则另外地在N-末端区域存在保守的基序[N/H]XDPAXLD(SEQIDNO35)；
其中X可以是任何不同的氨基酸；和
其中所述多肽的C-末端具有从GDP-岩藻糖结合结构域的第一个氨基酸开始的小于或等于100个氨基酸。
13.根据权利要求12所述的细胞，所述宿主细胞包含：i)包含编码具有乳糖结合α-1,3-岩藻糖基转移酶活性的所述多肽的多核苷酸的序列，其中所述序列对于所述宿主细胞是外源的序列并且其中所述序列整合在所述宿主细胞的基因组中，或ii)含有包含编码所述多肽的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸可操作地连接至由用所述载体转染的宿主细胞识别的控制序列。
14.根据权利要求12或13中任一项所述的细胞，其中所述多肽包含选自由以下项目组成的组的氨基酸序列：
i)所附序列表中SEQIDNO6、2、4、8、10、12、14、16、20、22、28、30或32的任何一个；
ii)与SEQIDNO2、20或22的全长氨基酸序列具有87％或更高序列同一性的氨基酸序列；
iii)与SEQIDNO6、8、10、12、14、16、28、30或32的任何一个的全长氨基酸序列具有80％或更高序列同一性的氨基酸序列；
iv)SEQIDNO2、20或22所示的氨基酸序列的片段，其中所述片段包含其至少45个连续氨基酸；
v)SEQIDNO6、8、10、12、14、16、28、30或32的任何一个所示的氨基酸序列的片段，其中所述片段包含其至少10个连续氨基酸并具有乳糖结合α-1,3-岩藻糖基转移酶活性；
任选地，所述多肽通过N-末端和/或C-末端氨基酸延伸片段进一步修饰。
15.根据权利要求3至11中任一项所述的方法或根据权利要求12、13或14中任一项的细胞，其中所述细胞选自由微生物、植物或动物细胞组成的组，优选地所述微生物是细菌、真菌或酵母，优选地所述植物是水稻、棉花、油菜籽、大豆、玉米或谷类植物，优选地所述动物是昆虫、鱼类、鸟类或非人类哺乳动物；优选地细胞是大肠杆菌细胞。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞是细菌、优选地是大肠杆菌菌株、更优选地是K12菌株的大肠杆菌菌株的细胞，甚至更优选地大肠杆菌K12菌株是大肠杆菌MG1655。
17.根据权利要求12至15中任一项所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞是酵母细胞。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的宿主细胞，其特征在于编码具有乳糖结合α-1,2-岩藻糖基转移酶活性的多肽的多核苷酸适合于相应...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·博普雷兹，N·兰诺，K·梵德瓦勒，A·瓦考特兰，
申请(专利权)人：因比奥斯公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE
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