靶向EPN1的抗体制造技术

本文中描述了epsin‑1(EPN1)的特异性抗体，该EPN1是表达于各种癌细胞的表面上的一种抗原。还描述了用于治疗、改善和诊断以EPN1表达的肿瘤细胞为特征的各种类型的癌症的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向EPN1的抗体
本专利
涉及用于治疗或检测癌症的基于抗体的疗法。
技术介绍
人类适应性免疫系统通过细胞(T细胞)过程和体液(B细胞)过程来作出应答。体液应答使得B细胞选择和克隆扩增，这些B细胞表达能够结合到抗原的表面结合免疫球蛋白(Ig)分子。体细胞超变和类别转换过程与克隆扩增一致地发生。这些过程共同地导致已针对靶抗原亲和力成熟且含有属于4个一般种类(M、D、A、G或E)中的一类的恒定结构域的分泌抗体。各类的抗体(IgM、IgD、IgA、IgG和IgE)都以不同方式与细胞免疫系统相互作用。已针对靶抗原亲和力成熟的抗体的标志可包括：1)相对于种系基因的核苷酸和(后续)氨基酸变化；2)与靶抗原的高结合亲和力；3)与其它蛋白质相比与靶抗原的结合选择性。众所周知，肿瘤患者可以针对肿瘤细胞抗原产生免疫应答。这些抗原可以源自在肿瘤内部导致突变蛋白的基因变化，或者原本正常的蛋白质向免疫系统的异常呈递。异常呈递可通过包括但不限于下列的过程而发生：新生儿蛋白的异位表达、细胞内蛋白在细胞表面的错误定位或细胞的裂解。酶的异常表达会导致蛋白质糖基化中的变化，也可以导致由体液免疫系统识别的非自身抗原的产生。选择性地结合到疾病相关蛋白(包括那些与癌症相关的)的抗体已被证明可成功地以产生治疗效果的方式来调节其靶蛋白的功能。人类免疫系统针对突变或者异常蛋白质产生抗体应答的能力表明，患者的免疫应答可包括能够识别关键肿瘤驱动因子且调节其功能的抗体。膜运输有助于对大范围细胞过程的调控。细胞表面受体的内化是适当调节生长因子受体介导的信号传导的关键机制。经由网格蛋白包被囊泡进行内化代表了肿瘤相关受体从表面内化的一种途径。将所述受体加载到网格蛋白包被小泡(CCPs)中用于随后内化于网格蛋白包被囊泡中是一种所述途径中的第一步骤。受体进入CCPs中的部分地取决于与衔接分子(如Epsin-1(EPN1)的相互作用。EPN1是一种定位在细胞膜的大约60.3kDa的蛋白质。其含有与PI(4,5)P2-、泛素-、和网格蛋白/AP-2相互作用结构域。下调EPN1的内源性表达、过度表达突变形式的EPN1、或使用被设计用于阻断EPN1与其载荷分子的相互作用的试剂处理细胞，都可以抑制已知CCP依赖性载荷的内化。这种载荷的实例是VEGFR和ERBB3。
技术实现思路
本专利技术提供用于蛋白质的特异性抗体，Epsin1(EPN1)，包括具有VH和VL骨架EPN1特异性抗体及分别与序列编号:4和8相关的互补区的EPN1特异性抗体、或其片段；以及具有一个或多个分别对应于序列编号:9-14的互补决定区(“CDRs”)H-CDR1、HCDR2、H-CDR3、L-CDR1、LCDR2和L-CDR3的EPN1特异性抗体。本专利技术还提供用于治疗、改善或诊断以EPN1表达肿瘤细胞为特征的各种类型癌症的组合物和方法。前述组合物和方法的实施方案包括天然抗EPN1抗体、其片段、其变体。例如，本专利技术抗体的实施例包括但不限于：单域抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)、和二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。在各种实施方案中，本专利技术抗体可含有保留VH区与VL区之间的正确折叠和稳定化所需的残基以及保留分子的低pI和低毒性的氨基酸序列修饰。在某些实施方案中，根据本专利技术的在治疗或诊断方法中所使用的抗体可以偶联到效应分子，包括治疗剂、诊断剂、或者半衰期和生物利用度提高分子。根据本专利技术的抗体可以由各种重组表达系统产生。这种系统包括宿主表达载体系统，这些宿主表达载体系统可用于通过用根据本专利技术的抗体的适当核苷酸编码序列来转化或转染细胞而表达根据本专利技术的抗体。在各种实施方案中，宿主表达细胞系统可以根据本专利技术抗体调节的插入序列编码的表达，或者根据需要修饰并处理抗体基因产物。如上所述，本专利技术的抗EPN1抗体可以使用于预防、治疗或改善受试者的癌症(例如肺癌或黑色素瘤)的组合物和方法。因此，在本专利技术的各种实施方案中，以足以抑制癌细胞的生长、复制或转移或者抑制癌症的体征或症状的量给受试者施用治疗有效量的抗体。在这些实施方案中，将抗体配制成适用于受试者的组合物施用方式的组合物。就使用本专利技术抗体来诊断或监测受试者中是否存在癌症的组合物和方法而言，可在某些实施方案中在体外或者在其它实施方案中在体内执行癌症的检测。本专利技术的一个实施方案还可以是用于检测EPN1阳性细胞的试剂盒。这种试剂盒通常将包含根据本专利技术的抗体组合物、为该试剂盒设计的特定应用的缓冲液和试剂、以及说明材料。附图说明图1是示出检测到的杂交瘤PR045-2H11产生的抗EPN1抗体与完整的活的癌细胞系的池结合的显微照片。将荧光团标记羊抗人IgG二级抗体与LI-CORSa成像系统联合使用，以检测PR045-2H11产生的抗体的结合。图2示出了在图1中所描绘在一个亚组的孔中所观察到的荧光信号的定量分析。实心黑条代表潜在筛选匹配，斑纹条代表背景信号，白色空心条代表阳性对照孔。图3示出了观察到的IMM20059与完整A549肺癌细胞系结合的浓度依赖性结合曲线。其使用AttuneTMNxT仪器(生命技术公司(LifeTechnologies))，通过流式细胞术测定。用荧光团标记抗人二级抗体来检测IMM20059与完整细胞的结合。图4示出了观察到的IMM20059与完整Huh7肝细胞癌细胞结合的浓度依赖性结合曲线。其使用AttuneTMNxT仪器(生命技术公司(LifeTechnologies))，通过流式细胞术测定。用荧光团标记抗人二次抗体来检测IMM20059与完整细胞的结合。图5示出了在严格(200mM和300mMNaCl)清洗条件下和在无清洗条件下通过65kDa蛋白的IMM20059的免疫沉淀的SDS-PAGE分辨率的扫描图像。图6示出了定量斑点杂交结果。其描绘了IMM20059对EPN1的选择性超过了其同源物EPN2。通过斑点杂交相对增加浓度的重组EPN1或EPN2来分析IMM20059的结合。图7示出了亲代HEK293及通过基于CRISPR的敲除而生成的HEK293的EPN1-/-变体的流式细胞术分析。用IMM20059或者市售的抗EPN1mAb将经固定和通透性的细胞进行染色。用经荧光团标记的抗人二级抗体对结合进行检测。图8是展示为针对H460人肺癌细胞系的IMM20059所观察的免疫荧光染色图案的显微照片。使用经荧光团标记的抗人二级抗体检测结合。图9是展示针对抗EPN1单克隆抗体与H460人肺癌细胞系所观察的免疫荧光染色图象的显微照片。用荧光团标记的抗小鼠二级抗体对结合进行检测。图10是大鼠EPN1分子(RCSBPDB:1edu)的EspinN-末端同源(ENTH)结构域的PyMOL衍生表现，该大鼠EPN1分子相对于人EPN1在氨基酸序列水平上100％保守。呈深灰色卡通图案的残基包含被鉴定为与IMM20059交联的蛋白水解衍生肽。呈浅灰色带状的残基位于交联肽的外侧。呈球形的残基代表直接交联到I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与蛋白Epsin1结合的经分离抗体或其抗原结合片段，包含可变重链(V

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181002 US 62/740,0921.一种与蛋白Epsin1结合的经分离抗体或其抗原结合片段，包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中：
A)所述VHC包含与对应于序列编号:2的氨基酸序列共有至少90％同源性的氨基酸；并且
B)所述VLC包含与对应于序列编号:4的氨基酸序列共有至少90％同源性的氨基酸。


2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，包含下列互补决定区(CDR)氨基酸序列中的至少一个：
CDR-H1，其对应于序列编号:9；
CDR-H2，其对应于序列编号:10；
CDR-H3，其对应于序列编号:11；
CDR-L1，其对应于序列编号:12；
CDR-L2，其对应于序列编号:13；和
CDR-L3，其对应于序列编号:14。


3.根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合到Epsin-1(EPN1)。


4.根据权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与EPN1之间的KD为50nM或更小。


5.根据权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中所述KD为1nM或更小。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段在结合到表达于细胞表面上的抗原之后被细胞内化。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是经分离可变重链(VH)单域单克隆抗体。


8.根据权利要求1至6中任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是单链(sc)Fv-Fc片段。


9.根据权利要求7或8所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含CH3支架，所述CH3支架包含衍生自免疫球蛋白Fc区的CH3结构域的野生型氨基酸序列的至少一个修饰。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗原结合片段，其中所述经分离抗原结合片段包含Fv、scFv、Fab、F(ab')2或Fab'片段、双抗体、或半衰期可能已增加的任何片段。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段是单克隆的。


12.根据权利要求11所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人的...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·K·罗宾逊，
申请(专利权)人：伊米若梅有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US