基于UPLC-MSMS检测工业大麻花叶中大麻素的方法技术

本发明专利技术涉及生物分析技术领域，特别是涉及一种基于UPLC‑MSMS检测工业大麻花叶中CBGA、CBG、CBC和CBCA含量的方法，通过UPLC‑MSMS检测出待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间偏差数，定性分析是否含有目标物。对于含有目标物的样品溶液，进一步进行定量测定。通过外标法定量，UPLC‑MSMS检测出待测物监测离子峰面积，与标准曲线对比，计算出目标物在样品溶液中的浓度。通过添加回收率和相对标准偏差RSD验证本发明专利技术的准确度和精密度，表明本方法对CBGA、CBG、CBC和CBCA的提取效率良好，可以满足工业大麻中CBGA、CBG、CBC和CBCA的分析测试。

【技术实现步骤摘要】
基于UPLC-MSMS检测工业大麻花叶中大麻素的方法
本专利技术涉及生物分析
，特别是涉及一种基于UPLC-MSMS检测工业大麻花叶中大麻萜酚酸(CBGA)、大麻萜酚(CBG)、大麻环萜酚(CBC)和大麻环萜酚酸(CBCA)的方法。
技术介绍
黑龙江省汉麻种植面积达45.7万亩，按照国家汉麻战略产业联盟的规划以及汉麻研究中心给全国的汉麻种植安排，黑龙江省初步定在前期大概用10年的时间达到300万亩。目前从大麻中已鉴定出约500种化合物。在这500余种化合物中最受研究者关注的就是大麻素。大麻素是特有的萜烯酚化合物，浓缩在植物毛状体产生的树脂分泌物中。这些毛状体主要集中在雌花序的特定部位。据报道，大部分的大麻素具有药用价值或医疗用途，例如：CBC的医疗用途为抗炎、抗肿瘤、抗抑郁、抗真菌、促进大脑生长等。CBG的药用价值：非精神活性成分，存在于大麻生长周期的早期，所以很难找到大量的CBG，这就意味着通过栽培大麻才能获得其医疗用途。CBG的医疗价值：可用为抗生素、可用于治疗银屑病、抗肿瘤、抗抑郁、止痛等。CBGA是CBG的前驱体，是大麻植株所产生的基础化合物。它对大麻生长有着保护作用，CBGA存在大麻花的毛状体中，并触发靶向植物细胞坏死，使大麻叶子得到自然“修剪”，为花体提供更多的生长能量。随着黑龙江省工业大麻产业的持续发展，种植面积的逐渐增加，对工业大麻中具有药用价值的大麻素含量测定的需求也逐渐增大。为了量化新鲜植物材料中曾经存在的“总CBG含量”、“总CBC含量”，必须将CBGA的浓度添加到CBG的含量中，将CBCA的浓度添加到CBC的含量中。但是目前国内没有统一的对工业大麻花叶中CBGA、CBG、CBC和CBCA含量检测的标准和方法。
技术实现思路
本专利技术为了克服上述技术问题的不足，提供了一种基于UPLC-MSMS检测工业大麻花叶中CBGA、CBG、CBC和CBCA的方法。解决上述技术问题的技术方案如下：基于UPLC-MSMS检测工业大麻花叶中CBGA、CBG、CBC和CBCA的方法，包括以下步骤：(1)前处理将采集的花叶、叶片、种子、茎秆通风阴干，去除杂质后分别置于研磨器中研磨后，过50目筛，制成试样，并置于-18℃条件下保存；按照GB5009.3测定样品中的含水量，计算试样中干物质的含量；(2)提取和净化精确称取待测样品0.1～1g，精确到至少0.01g，置于50mL离心管中，向离心管中加入90+10的甲醇-正己烷溶液25mL，涡旋提取15min，5000r/min离心3min；将上清液全部转移至50mL容量瓶中，再次向残渣中加入90+10甲醇-正己烷溶液25mL，涡旋提取15min，5000r/min离心3min，合并提取液，定容至50mL，混合均匀后取2mL混合液经0.22μm有机系滤膜过滤；(3)检测将步骤(2)得到的净化待测物经过UPLC-MSMS法进行检测；UPLC参数为：色谱柱：AcquityHSST3(50mm×2.1mm，1.8μm)，柱温：35℃，流速：0.30mL/min，进样量：2μL，梯度洗脱条件如下表1所示：MSMS条件为离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子扫描和负离子扫描；毛细管电压：3.0KV；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流量：1000L/h；锥孔气流量：150L/h；检测方式：多重反应监测(MRM)如下表2所示：(4)定性测定在相同检测条件下，待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间偏差在±2.5％之内，则判断样品中存在对应的待测物。所述的标准工作溶液中的保留时间为大麻环萜酚5.22min，大麻环萜酚酸4.15min，大麻萜酚酸4.07min，大麻萜酚4.10min。所述的偏差为相对标准偏差(RSD)，计算公式如下：式中：RSD为相对标准偏差；Rn为第n个重复的回收率，n＝5；为平均回收率。定性判断含有对应待测物的样品进一步定量测定，所述定量测定的步骤如下：标准工作液与试样交替进样，采用单点或多点校准，外标法定量；当样品的上机液浓度超过线性范围时，需根据测定浓度，稀释后进行重新测定；样品中大麻素含量按公式(1)计算：式中：X为样品中被测组分含量，单位为毫克每克(mg/g)；C为从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；V为试样溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m为试样的质量，单位为克(g)；ω为试样的干物质含量(质量分数)，％；平行测定结果用算术平均值表示，计算结果保留小数点后两位有效数字。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种基于UPLC-MSMS检测工业大麻花叶中CBGA、CBG、CBC和CBCA含量的方法，通过UPLC-MSMS检测出待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间偏差数，定性分析是否含有目标物。对于含有目标物的样品溶液，进一步进行定量测定。通过外标法定量，UPLC-MSMS检测出待测物监测离子峰面积，与标准曲线对比，计算出目标物在样品溶液中的浓度。将CBGA、CBG、CBC和CBCA配置成含0.1、1、10、100、1000ng/mL的混合标准工作溶液，CBGA、CBG、CBC和CBCA的峰面积y和浓度x(ng/mL)做工作曲线，其标准曲线如下：CBGA：线性方程为：y＝6681706x+648，R2＝0.9996；CBG：线性方程为：y＝9981716x–1036，R2＝0.9995。CBC：线性方程为：y＝443512x–15664，R2＝0.9995；CBCA：线性方程为：y＝489252x–15047，R2＝0.9997。按照噪音理论确定该方法检测CBGA、CBG、CBC和CBCA的最低检出限LOD(3倍信噪比)均为0.03ng/g，最低定量限LOQ(10信噪比，同时符合回收率和变异系数要求)均为0.1ng/g。通过添加回收率验证本专利技术的准确度，CBGA和CBG的提取回收率为94.7-99.7％，CBC和CBCA的提取回收率为89.6％-99.7％，通过相对标准偏差RSD验证本专利技术的精密度，CBGA、CBG、CBC和CBCA的RSD值均小于5％，表明本方法对CBGA、CBG、CBC和CBCA的提取效率良好，可以满足工业大麻中CBGA、CBG、CBC和CBCA的分析测试。该方法操作简便，快捷，准确，高效，不仅可以定性分析还可以定量分析测定，可同时测定大麻花叶中CBGA、CBG、CBC和CBCA含量。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。实施例1：(1)前处理将采集的花叶、叶片、种子、茎秆通风阴干，去除杂质后分别置于研磨器中研磨后，过50目筛，制成试样，并置于-18℃条件下保存；按照GB5009.3测定样品中的含水量，计算试样中干物质的含量；(2)提取和净化<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于UPLC-MSMS检测工业大麻花叶中大麻素的方法，所述的大麻素包括大麻萜酚酸、大麻萜酚、大麻环萜酚和大麻环萜酚酸，其特征在于，采用90+10的甲醇-正己烷溶液对待测物样品进行涡旋萃取，萃取液经过净化后采取UPLC-MSMS法进行检测，定性测定含有目标物的样品进一步定量测定。/n

【技术特征摘要】
1.基于UPLC-MSMS检测工业大麻花叶中大麻素的方法，所述的大麻素包括大麻萜酚酸、大麻萜酚、大麻环萜酚和大麻环萜酚酸，其特征在于，采用90+10的甲醇-正己烷溶液对待测物样品进行涡旋萃取，萃取液经过净化后采取UPLC-MSMS法进行检测，定性测定含有目标物的样品进一步定量测定。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)前处理
将采集的花叶、叶片、种子、茎秆通风阴干，去除杂质后分别置于研磨器中研磨后，过50目筛，制成试样，并置于-18℃条件下保存；按照GB5009.3测定样品中的含水量，计算试样中干物质的含量；
(2)提取和净化
精确称取待测样品0.1～1g，精确到至少0.01g，置于50mL离心管中，向离心管中加入90+10的甲醇-正己烷溶液25mL，涡旋提取15min，5000r/min离心3min；将上清液全部转移至50mL容量瓶中，再次向残渣中加入90+10甲醇-正己烷溶液25mL，涡旋提取15min，5000r/min离心3min，合并提取液，定容至50mL，混合均匀后取2mL混合液经0.22μm有机系滤膜过滤；
(3)检测
将步骤(2)得到的净化待测物经过UPLC-MSMS法进行检测；
(4)定性测定
在相同检测条件下，待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间对比，判断样品中是否存在对应的待测物。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的检测的UPLC参数为：色谱柱：AcquityHSST3(50mm×2.1mm，1.8μm)，柱温：35℃，流速：0.30mL/min，进样量：2μL，梯度洗脱条件如下表1所示：










t/min
流速(mL/min)
乙腈(％)
0.1％甲酸水(...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国峰，刘峰，张晓波，董见南，黄文功，廖辉，张瑞英，程爱华，史冬梅，金海涛，任红波，马文琼，潘博，李宛，孙丽荣，尤红梅，孙悦萍，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23