一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法。所述引物组包括上游引物及下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术利用一组特异性的引物，通过将微量的DNA大幅增加来进行检测，具有特异性强、灵敏度高，结果准确的优点，从而使得其具有良好的市场应用前景和推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及植物病原菌分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
柑桔溃疡病菌(Xanthomonascitrisubsp.citri)既是国内的植物检疫对象，更是我国禁止入境的对外检疫对象。该病原属于黄单胞杆菌属植物病原细菌，该病危害柑桔叶片、枝梢和果实。苗木和幼树受害特别严重会造成落叶、枯梢，影响树势；果实受害重者落果，轻者带有病疤不耐贮藏，发生腐烂，大大降低果实的商品价值，在未发生过该病的国家或地区发现病树时，目前只能采取烧毁病苗的方式进行处置，种植者和生产区会损失惨重。柑桔溃疡病菌对在亚洲、南美洲、大洋洲和非洲很多国家，以及美国佛罗里达州广泛存在的热带和亚热带条件下种植的(CABI，2006：EPPO，2006)，以柑橘属(Citrusspp.)、金橘属(Fortunellaspp.)和枳属(Poncirusspp.)为主的很多芸香科(Rutaceae)栽培种造成危害(EPPO，1979)。一些寄主范围有限的非典型柑橘溃疡病菌菌株已被鉴定并命名为菌株A*和Aw(Sun等，2004；Vernière等，1998)。菌株A*自然条件下在亚洲危害墨西哥莱檬(Citrusaurantiifolia)。菌株Aw自然条件下在美国佛罗里达引起墨西哥莱檬和大叶莱檬(Citrusmacrophylla)溃疡(Cubero和Graham，2002，2004)。均有报道称这两个菌株在实验条件下会在其他柑桔种类上引起非典型病变(Escalon等，2013)。柑桔溃疡病菌可以作为寄主或非寄主植物的表生菌在病变组织中存活，也可以作为腐生菌在稻草覆盖物或土壤中生存。在越冬病斑，尤其是在嫩梢上形成的病斑是下一季最重要的侵染源。近距离扩散的主要机制是风雨和植株内、植株间的飞溅的水花：细菌随流经病斑表面的雨水传播，并飞溅到健康枝梢上(CABI，2006)。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供了一种快速、准确的柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法。在本专利技术的一方面，提供一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组，所述引物组包括上游引物及下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的另一方面，提供一种柑桔溃疡病菌的PCR检测试剂盒，其包括上述的引物组。进一步地，其中前述的PCR检测试剂盒中，其中所述PCR检测试剂盒还包括12.5μL的2×PremixTaq缓冲液、100ng/μL的阳性对照和100ng/μL的阴性对照。进一步地，前述的PCR检测试剂盒中，其中所述阳性对照为20μL的柑桔溃疡病菌(Xanthomonascitripv.citri)的基因组DNA。进一步地，前述的PCR检测试剂盒中，其中所述阴性对照管为黄单孢20μL的杆菌属草莓黄单孢菌(Xanthomonasfragarice)的基因组DNA。进一步地，前述的PCR检测试剂盒中，其中还包括9.5-10.5mL的无菌水。进一步地，前述的PCR检测试剂盒中，其中所述上游引物、下游引物以混合液的形式存在，均溶解在同一TE缓冲液中。进一步地，前述的PCR检测试剂盒中，其中所述上游引物的工作浓度为10μmol/L，下游引物的工作浓度为10μmol/L。在本专利技术的另一方面，提供一种不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法，包括以下步骤：S1.提取DNA作为反应的模板；S2.采用所述的引物进行PCR检测。进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法中，其中步骤S1中，所述提取DNA的步骤包括：1)采集待测样本：将待测样本充分研磨至粉末状，得到研磨样品；2)提取样本基因组：采用磁珠法提取研磨样品中的DNA，获得待测样本的模板DNA。进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法中，其中所述待测样本为植物发病部位组织或干重组织，将待测样本加入液氮后充分研磨至80-100微米；所述植物发病部位组织或干重组织与液氮的重量比例为1：(0.8-2)。进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法中，其中步骤2)中，所述磁珠法是通过植物基因组DNA提取试剂盒进行的。进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法中，其中步骤S2中，所述PCR检测反应体系为25μL；其中模板DNA2μl，扩增反应液2xPremixTaq，12.5μl；10μmol/L所述的引物各1μL，和无菌水8.5μL。进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法中，其中步骤S2中，所述PCR检测的反应程序为：95℃预变性4min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃继续延伸10min，4℃下保存。本专利技术的原理在于针对柑桔溃疡病菌的Xcc49chromosome基因序列设计并筛选出的一组特异性引物，用于柑桔溃疡病菌的普通PCR特异性检测，从而为检测柑桔溃疡病菌(Xanthomonascitrisubsp.citri)提供新的检测方法。本专利技术相比于现有技术至少具有以下有益效果：本专利技术通过设计一组特异性引物并采用普通PCR方法来检测柑桔溃疡病菌，可以实现快速、方便、高效的检测目的。本专利技术利用一组特异性的引物，通过将微量的DNA大幅增加来进行检测，具有特异性强、灵敏度高，结果准确的优点，从而使得其具有良好的市场应用前景和推广应用价值。本专利技术通过设计一组柑桔溃疡病菌的特异性引物，并对反应体系进行了优化，建立了针对该菌株的PCR检测，能够在受到单一病原菌或至少两种病原菌复合侵染的样本中检测出该病原菌，而且整个检测能控制在3个小时内完成，提高了工作效率，特别符合国境口岸快速检测、快速通关的需求。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。附图说明图1为应用本专利技术的引物所建立的普通PCR特异性实验检测图，其中，M为Marker；1为柑桔溃疡病菌(Xanthomonascitripv.citri)；2～8分别为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestrispv.campestris)、辣椒疮痂病菌Xanthomonaseuvesicateria、野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种(Xanthomonasvesicatoria)、野油菜黄单胞菌梅氏致病变种(Xanthomonasaxonopodispv.melhusii)、茄科植物细菌性斑点病菌(Xanthomonasperforans)、细菌性疮痂病菌(Xanthomonasgardneri)及草莓角斑病菌(Xanthomonasfr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物及下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物及下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种柑桔溃疡病菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的引物组。


3.如权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括扩增反应液2xPremixTaq和1-2μg/ml的阳性对照。


4.如权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物以混合液的形式存在，均溶解在同一TE缓冲液中。


5.如权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物的工作浓度为10μmol/L，下游引物的工作浓度为10μmol/L。


6.一种不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取DNA作为反应的模板；
S2.采用权利要求1所述的引物进行PCR检测。


7.如权利要求6所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述提取DNA的步骤包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆卫峰，高文娜，郑春生，边勇，
申请(专利权)人：中国海关科学技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11