一种贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株的发酵方法技术

本发明专利技术提供一种贝莱斯芽孢杆菌(

【技术实现步骤摘要】
一种贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株的发酵方法
本专利技术涉及微生物领域，更具体地说是涉及一种贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株的发酵方法。
技术介绍
现有技术中，有人报道贝莱斯芽孢杆菌在秸秆降解及污水氨氮降解方面的应用，也有人报道在铝毒土壤修复、缓解铝毒胁迫以及提高植物抗铝毒胁迫能力中应用，还有人报道能防治花生根腐病的贝莱斯芽孢杆菌。但是，现有技术中，缺乏能够同时解磷、可降解农药残留、对植物病原菌具有拮抗作用的微生物，更缺乏该类微生物高效、高活菌含量的发酵方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)SUNO-18S-36株的发酵方法，该微生物具有解磷、降解农药残留的功能，对病原菌具有拮抗作用，采用本专利技术发酵方法，可以在较短的时间内，得到高活菌含量、高芽孢率、高抑菌活性物质的发酵液。本专利技术的目的采用如下技术方案实现：一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)SUNO-18S-36株的发酵方法，采用如下培养基：葡萄糖4～10g/L、玉米浆5～20g/L、酵母粉5～25g/L、蚕蛹粉5～10g/L、碳酸钙0～10g/L、葡萄糖酸钙0～30g/L、七水硫酸镁0.1～1g/L、硫酸锰0～0.1g/L、磷酸钙0～10g/L，pH7.0～7.5。在本专利技术中，所述培养基含有葡萄糖4～6g/L、玉米浆14～16g/L、酵母粉11～13g/L、蚕蛹粉6.5～8.5g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、葡萄糖酸钙14～16g/L、硫酸锰0.05～0.08g/L、磷酸钙4～6g/L，pH7.0～7.5。在本专利技术中，先采用基础培养基进行发酵，在发酵过程中流加补料培养基；所述基础培养基中含有葡萄糖4～6g/L、玉米浆4～6g/L、酵母粉7～9g/L、蚕蛹粉6.5～8.5g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、葡萄糖酸钙14～16g/L、磷酸钙4～6g/L，pH7.0～7.5；所述补料培养基添加后，发酵液中玉米浆、酵母粉、硫酸锰的总浓度分别为：玉米浆14～16g/L、酵母粉11～13g/L、硫酸锰0.05～0.08g/L。在本专利技术中，发酵过程中控制：通气比为(0.8～1.2):1、温度28℃～32℃、转速200～300rpm、罐压0.03～0.08MPa，发酵时间为30～60小时。在本专利技术中，当发酵液中的溶氧>14.5％时，流加补料培养基；当发酵液中的溶氧≤14.5％时，停止补料。在本专利技术中，培养后的发酵液在30～50℃进行加热处理。在本专利技术中，发酵液在30～40℃加热3～6min、然后在40～50℃加热5～15min。有益效果：采用本专利技术的培养基和培养工艺，可以得到高活菌含量、高芽孢率、高抑菌活性物质的贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36的发酵液。由于芽孢抗逆性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性，因此高芽孢率将显著提高贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36菌剂或菌肥的稳定性，这有利于后续以贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36发酵液为原料的菌剂或菌肥的加工制备，为贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36的产业化奠定坚实的基础。附图说明图1SUNO-18S-36株显微镜(1000X)观察照片。图2SUNO-18S-36株的菌落形态。具体实施方式本专利技术中培养基使用的溶剂为水。通气比是指每分钟通气量(m3)与发酵液体积(m3)之比。接种量是接入的种子液的体积与培养基体积的比例。本专利技术中贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株的活化方法：从贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株的斜面中，用无菌接种针挑取部分菌苔至LB液体培养基摇瓶中(250mL摇瓶装液量50ml)，在30℃、150r/min下培养24h后，LB培养基变浑浊。取菌液至LB固体培养基中划线培养24h～36h，即得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株。各实施例中的种子液均按照如下方法制备：500mL种子摇瓶中LB液态培养基的装液量为100ml。挑取活化后的贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株接种于种子摇瓶中，将种子摇瓶在30℃、150r/min下培养24h，得到种子液。发酵液中活菌含量采用稀释涂平板法，具体见行业标准NY/T2321-2013中相关内容。发酵液中芽孢率的测定方法，包括如下步骤：(1)取发酵结束时的发酵液，分装在250mL无菌三角烧瓶中，每瓶30mL，6瓶备用。(2)恒温水浴锅(带震荡)设置温度(80±1)℃，待温度稳定后，备用。(3)上述6个三角烧瓶，取3个三角烧瓶常温下震荡20min，稀释涂平板测定活菌含量。取平均值记为VCK。(4)另外3个三角烧瓶，置于80℃的水浴锅中恒温震荡20min(震荡频率与常温下的对照处理时相同)后，立马取出，自来水降温至室温后，稀释涂平板检测活菌含量，取平均值记为V处理。(5)采用如下公式计算芽孢率：芽孢率：＝V处理/VCK×100％。本申请中发酵液抑菌活性物质含量测定方法：(1)实验室保藏的西瓜枯萎病病原菌(F.oxysporum)在PDA斜面培养基上28℃活化24h(28℃培养)；再划线接种PDA平板培养基，28℃恒温培养，直至长出孢子。(2)用无菌生理盐水洗下孢子，得西瓜枯萎病病原菌孢子液，血球板计数后，冰箱冷藏备用。(3)SUNO-18S-36株待测发酵液离心后，取上清液，过0.22um的无菌滤膜，得到的无菌清液备用。(4)将西瓜枯萎病原菌孢子液用PDA液体培养基稀释，制备1×105个/mL的西瓜枯萎病原菌孢子的悬浮液；(5)取无菌试管15只(一组试管)，排成一排，每管中加入2mL浓度为1×105个/mL的枯萎病病原菌孢子悬浮液。(6)在第1管中加入2mL待测发酵原液处理后所得的无菌清液，混匀后，吸取2mL混合液到第2管中，如此连续，稀释至第14管，混匀后从第14管中吸取2mL弃去。第15管作为对照。在稀释过程中，每次吸取2mL到下一个试管后，要换掉移液管。(7)此时，从第1管开始到第14管，与原发酵无菌清液对比，分别稀释了21、22、23……214倍。(8)上述实验，重复3组。(9)将混合好的试管塞好塞子，置于28℃的恒温箱中培养36h。若检查对照管中西瓜枯萎病病原菌生长情况良好，那么，以肉眼观察，稀释倍数最大的管无菌体生长，该最大的稀释倍数即为发酵液无菌清液的MIC(最小抑菌含量)，也将该最大的稀释倍数对应的稀释液中抑菌活性物质的量定义为1个活性单位(1U)。原发酵液无菌清液的抑菌活性物质含量＝最大的稀释倍数×1U，单位为U/ml。实施例1菌株筛选及鉴定一.菌株的分离、筛选1.材料与方法1.1样品一般田块番茄地病株2株、根际土壤样品3个；一般田块西瓜地病株2株、根际土壤样品3个；盐渍化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株的发酵方法，其特征在于，采用如下培养基：葡萄糖4～10g/L、玉米浆5～20g/L、酵母粉5～25g/L、蚕蛹粉5～10g/L、碳酸钙0～10g/L、葡萄糖酸钙0～30g/L、七水硫酸镁0.1～1g/L、硫酸锰0～0.1g/L、磷酸钙0～10g/L，pH7.0～7.5。/n

【技术特征摘要】
1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)SUNO-18S-36株的发酵方法，其特征在于，采用如下培养基：葡萄糖4～10g/L、玉米浆5～20g/L、酵母粉5～25g/L、蚕蛹粉5～10g/L、碳酸钙0～10g/L、葡萄糖酸钙0～30g/L、七水硫酸镁0.1～1g/L、硫酸锰0～0.1g/L、磷酸钙0～10g/L，pH7.0～7.5。


2.根据权利要求1所述发酵方法，其特征在于所述培养基含有葡萄糖4～6g/L、玉米浆14～16g/L、酵母粉11～13g/L、蚕蛹粉6.5～8.5g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、葡萄糖酸钙14～16g/L、硫酸锰0.05～0.08g/L、磷酸钙4～6g/L，pH7.0～7.5。


3.根据权利要求1或2所述发酵方法，其特征在于先采用基础培养基进行发酵，在发酵过程中流加补料培养基；所述基础培养基中含有葡萄糖4～6g/L、玉米浆4～6g/L、酵母粉7～9g/L、蚕蛹粉6.5～8....

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓军，邹玲玲，丰超，王玲丽，李勇，
申请(专利权)人：苏农广德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34